His標(biāo)簽抗體在WB蛋白篩選和ELISA分析中的應(yīng)用

His標(biāo)簽是一種流行的重組蛋白的添加物，以促進(jìn)蛋白質(zhì)的純化和檢測(cè)。His標(biāo)簽的使用通常優(yōu)先于其他標(biāo)簽，因?yàn)榭墒褂孟鄬?duì)便宜的樹脂進(jìn)行純化，如NiNTA。Anti-His Tag抗體能夠檢測(cè)標(biāo)記的蛋白，從而篩選表達(dá)。多聚his標(biāo)簽通常由6個(gè)組氨酸殘基組成，但也可能在3 - 10個(gè)組氨酸殘基之間，通常位于重組蛋白的C端或n端。在這里，我們給大家介紹Jackson ImmunoResearch公司的Anti-His Tag抗體對(duì)his標(biāo)記蛋白的WB和ELISA中的應(yīng)用。

使用WB在細(xì)胞裂解液中篩選his標(biāo)記的蛋白
從細(xì)胞裂解物中篩選his標(biāo)記的重組蛋白(構(gòu)建)是抗his標(biāo)簽抗體的一種流行應(yīng)用。Anti-His Tag抗體允許檢測(cè)羧基端和氨基端his標(biāo)記蛋白。圖1展示了從哺乳動(dòng)物、昆蟲和細(xì)菌細(xì)胞裂解液中檢測(cè)重組his標(biāo)記蛋白的結(jié)果。

圖  1：在一系列細(xì)胞裂解物中檢測(cè) His 標(biāo)簽蛋白。以100 ng的濃度將C末端His-Tagged蛋白添加到細(xì)胞裂解物中。將HEK 293、CHO、BL21 E.Coli和Sf9昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞裂解物還原并在100°C下煮沸5分鐘，然后以9μg/孔的速度加載到串聯(lián)SDS凝膠中。A.蛋白質(zhì)印跡。將凝膠電印跡到硝酸纖維素膜上，用PBS/0.2%  Tween  20中的5% BSA封閉，并用Jackson  ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)探測(cè)以1:20K稀釋并使用數(shù)字成像儀進(jìn)行可視化。 B.凝膠用Coomassie染色。

使用偶聯(lián)的Anti-His Tag抗體進(jìn)行直接檢測(cè)法WB實(shí)驗(yàn)
Jackson ImmunoResearch公司的Anti-His Tag抗體可以直接使用HRP偶聯(lián)物。圖2和3顯示了JIR公司的HRP Rabbit Anti-His Tag抗體可以在不同稀釋倍數(shù)范圍內(nèi)使用，并且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同his標(biāo)記蛋白的敏感檢測(cè)。Western blot檢測(cè)的靈敏度可以通過間接進(jìn)行檢測(cè)來提高，使用偶聯(lián)二抗體來實(shí)現(xiàn)以下部分所示的信號(hào)增強(qiáng)。

圖2. WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用兩種濃度的HRP Rabbit Anti-His Tag抗體檢測(cè)His-Tagged蛋白。

具體實(shí)驗(yàn)步驟：將重組His-Tagged蛋白還原，在100℃下煮沸5分鐘，裝入50、100和250 ng/孔的SDS凝膠中。將凝膠電泳到硝化纖維膜上，然后將膜減半，每組樣品在1:5K或1:50K下使用Jackson ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240)進(jìn)行探針檢測(cè)。用數(shù)字成像儀顯示得到的條帶，1:5K印跡暴露3秒，1:50K印跡暴露21秒。
 

圖3. 直接Western blot檢測(cè)HRP兔抗- his Tag抗體對(duì)4種重組His-Tagged蛋白的檢測(cè)限。

具體實(shí)驗(yàn)步驟：將4個(gè)重組His-Tagged蛋白還原，在100℃下煮沸5分鐘，分別裝入50 ng/孔和250 ng/孔的SDS凝膠中。1、2、4號(hào)通道含有c端標(biāo)記蛋白，3號(hào)通道含有n端標(biāo)記蛋白。將凝膠電泳到硝化纖維膜上，用Jackson ImmunoResearch的HRP Rabbit Anti-His Tag(300-035-240)稀釋1:20K進(jìn)行探針檢測(cè)。結(jié)果的波段用數(shù)字成像儀顯示出來。

將Anti-His Tag抗體與Anti-Rabbit偶聯(lián)物結(jié)合，提高結(jié)果靈敏度
信號(hào)放大可以通過使用Anti-His Tag抗體和與Anti-Rabbit抗體(如HRP Goat Anti-Rabbit二抗)相結(jié)合的方法間接檢測(cè)His標(biāo)簽來實(shí)現(xiàn)。圖4顯示，相對(duì)于直接檢測(cè)法(A)，使用間接兩步法(B)可以提高靈敏度。

圖4. 四種重組his標(biāo)簽蛋白的直接和間接Western blot檢測(cè)比較。

具體實(shí)驗(yàn)步驟：將his標(biāo)記的蛋白在含有5% β -巰基乙醇(BME)的SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸并還原，并以50 ng/孔加載，詳細(xì)信息如上。凝膠被電印跡到硝化纖維素上，并進(jìn)行了印跡探測(cè)。A)直接:HRP Rabbit Anti-His Tag(300-035-240)稀釋1:20K。B)間接法:Rabbit Anti-His Tag(300-005-240)稀釋1:5K，然后使用HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Hu, Ms, Rat Sr Prot)(111-035-144)稀釋1:20K。用數(shù)字成像儀對(duì)印跡進(jìn)行可視化。

Anti-His Tag抗體在ELISA中的應(yīng)用
圖5顯示了一系列重組His-Tagged羊駝VHH抗體的結(jié)合特性的變化，這些抗體從抗antigen X的活性篩選中分離出來，并通過ELISA進(jìn)行分析。不同的納米體的結(jié)合親和力的變化可以被清楚地識(shí)別和以供實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行選擇。

圖5. 使用HRP Rabbit Anti-His Tag (300-035-240) 在ELISA實(shí)驗(yàn)中對(duì)His標(biāo)簽蛋白進(jìn)行檢測(cè)

具體實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)：
1.抗原包被：Antigen X以1μg/孔(100 ul, 10 μg/ml)涂于平板上。用1% Bovine Serum Albumin (IgG-Free, Protease-Free） (001-000-162)在PBST中阻斷平板。
2.樣本：5個(gè)純化his標(biāo)記的重組羊駝VHH抗抗原X抗體(Protein 1-5)，連續(xù)稀釋20 ng (100 ul @ 200 ng/ml); 1:2穿過盤子。
3.檢測(cè)抗體：HRP Rabbit Anti-His Tag(300-035-240)按1:20 000稀釋(每孔100 μl)。
4.平板與TMB在室溫孵育30分鐘，用平板閱讀器在620 nm時(shí)讀取實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

使用ELISA篩選來捕獲his標(biāo)簽蛋白
His-Tag提供了另一種捕獲蛋白質(zhì)的方法，這種方法在處理具有構(gòu)象敏感性的蛋白質(zhì)時(shí)可能很有用，它可以使蛋白質(zhì)高于板表面，使更多的抗原表位可被免疫試劑接近。Anti-His Tag抗體的另一個(gè)應(yīng)用是在目標(biāo)蛋白特異性抗體有限的情況下，但該檢測(cè)需要兩種不同的抗體來生成三明治格式。通過His標(biāo)簽捕獲，目標(biāo)蛋白特異性抗體可用于檢測(cè)與結(jié)合物種特異性二抗的復(fù)合物，允許最佳的信號(hào)擴(kuò)增。His-Tag捕獲還提供抗體介導(dǎo)的，快速和一致的抗原結(jié)合到ELISA板。

圖6。Rabbit Anti-His Tag (300-005-240)間接夾心ELISA法檢測(cè)his標(biāo)記蛋白。

1.捕獲抗體: AffiniPure Rabbit Anti-His Tag(300-005-240)包被1μg/孔(100 μl, 10 μg/ml)。用1% Bovine Serum Albumin (IgG-Free, Protease-Free)(001-000-162)在PBST中阻斷平板
2.樣品:His-Tagged SARS-CoV-2刺突蛋白R(shí)BD (Genscript - Z03483-100)，負(fù)載在20 ng/孔(100 μl @ 200 ng/ml)。 
3.檢測(cè)抗體1:人抗sars - cov -2 IgG Spike S1抗體(Genscript A02038)。第一口孔40 ng (100 ul @ 400 ng/ml);連續(xù)稀釋1:2橫跨板。 
4.檢測(cè)抗體2:HRP Goat Anti-Human IgG, Fcγfragment specific (min X Bov, Ms, Rb Sr Prot) (109-035-170)稀釋1:20 000 (100μl /孔)。 
5.平板與TMB在室溫孵育30分鐘，用平板閱讀器在620 nm讀取。

*實(shí)驗(yàn)tip：在捕獲過程中使用兔抗體時(shí)，建議使用與兔血清蛋白交叉吸附的檢測(cè)抗體，以避免背景的產(chǎn)生。Jackson ImmunoResearch研的抗體，包括anti-human抗體，對(duì)多種宿主可以消除其交叉反應(yīng)性，使得不同宿主物種都能消除高背景。