電致化學(xué)發(fā)光成像裝置的原理、新進(jìn)展和應(yīng)用

科技前沿丨電致化學(xué)發(fā)光成像
 

本文作者：趙微 博士

電致化學(xué)發(fā)光（electrogenerated chemiluminescence，ECL），又稱電化學(xué)發(fā)光，源于電化學(xué)反應(yīng)電子傳遞過程中將電能轉(zhuǎn)化為輻射能的過程。發(fā)光分子在電極表面經(jīng)過氧化還原過程生成激發(fā)態(tài)，進(jìn)而退激產(chǎn)生發(fā)光。

針對(duì)電致化學(xué)發(fā)光的詳細(xì)研究始于二十世紀(jì)六十年代，隨著電子技術(shù)以及高靈敏的光電傳感器如光電倍增管、單光子計(jì)數(shù)器的出現(xiàn)，電致化學(xué)發(fā)光傳感得到了迅猛發(fā)展。
近年來，結(jié)合光學(xué)顯微鏡與電子倍增圖像傳感器（EMCCD）的電化學(xué)發(fā)光顯微鏡（ECLM）獲得了極大的關(guān)注，成為電化學(xué)測量中一種創(chuàng)新性的技術(shù)手段。

電化學(xué)發(fā)光成像具有低背景、無光熱效應(yīng)、高通量、高時(shí)間分辨率、可控性好等優(yōu)點(diǎn)，為研究微納界面電化學(xué)反應(yīng)過程提供了極具發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)手段。這種成像技術(shù)在能源、材料及生命分析領(lǐng)域，具有卓越的應(yīng)用前景。

 

    1. 電致化學(xué)發(fā)光原理    

電致化學(xué)發(fā)光是一種在電極表面通過電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)^[1]。在外加電激勵(lì)下，電極表面首先發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光所需的活性中間體，隨后中間體之間或者中間體與共反應(yīng)劑提供的高能自由基之間相互作用，形成激發(fā)態(tài)物種，進(jìn)一步退激產(chǎn)生發(fā)光。根據(jù)發(fā)光機(jī)理的不同，ECL現(xiàn)象被分為“湮滅型”和“共反應(yīng)劑型”兩種途徑^[2]。

1.1 湮滅型ECL

如圖1所示，在湮滅型 ECL 中，通過施加雙向電刺激，反應(yīng)體系內(nèi)分別產(chǎn)生發(fā)光物種的氧化態(tài)和還原態(tài)中間體，兩種中間體反應(yīng)生成高能激發(fā)態(tài)分子，進(jìn)一步退激至基態(tài)產(chǎn)生發(fā)光。
 

1.2 共反應(yīng)劑型ECL

相較于湮滅型ECL，共反應(yīng)劑型ECL通常具有更高的發(fā)光效率，因此電致化學(xué)發(fā)光發(fā)光成像通�；�于此種模式。

共反應(yīng)劑型ECL只需施加單向電位。該體系中的共反應(yīng)劑提供了高能自由基，這些自由基能夠與發(fā)光體反應(yīng)，從而達(dá)到激發(fā)態(tài)。共反應(yīng)劑ECL的機(jī)制包括“氧化還原”和“還原氧化”兩種路徑。以“氧化還原”ECL為例（圖2A），其反應(yīng)過程通常遵循三個(gè)步驟：

（1）電極表面的氧化反應(yīng)；

（2）共反應(yīng)劑（如三正丙胺（TPrA））生成強(qiáng)還原自由基；

（3）共反應(yīng)劑自由基使氧化的發(fā)光中間體還原，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)物種。

相應(yīng)的，在“還原氧化”路徑中（圖2B），共反應(yīng)劑（如S2O82-）產(chǎn)生強(qiáng)氧化自由基，該自由基進(jìn)一步與還原態(tài)發(fā)光物種反應(yīng)生成激發(fā)態(tài)。
 

圖2. “氧化還原”（A）和“還原氧化”（B）共反應(yīng)劑型ECL機(jī)制

 

    2. 電致化學(xué)發(fā)光裝置    

ECLM成像裝置的核心部件包括電化學(xué)反應(yīng)池、電化學(xué)工作站、正置或倒置顯微鏡、以及CCD或EMCCD（圖3）。為提高圖像分辨率，通常會(huì)選用高數(shù)值孔徑（N.A.）的物鏡。

此外，信號(hào)發(fā)生器可作為輔助裝置，對(duì)電觸發(fā)與光采集進(jìn)行同步。在成像操作中，關(guān)閉外部光源后，利用電位階躍或循環(huán)伏安法觸發(fā)電化學(xué)反應(yīng)，同步采用CCD或EMCCD實(shí)時(shí)捕獲ECL圖像。
 

圖3. ECL 顯微成像系統(tǒng)的示意圖及典型裝置

    3. 電致化學(xué)發(fā)光成像進(jìn)展    

從上世紀(jì)80年代至今，電致化學(xué)發(fā)光成像經(jīng)歷了蓬勃的發(fā)展。

1987年，Engstrom等報(bào)導(dǎo)了采用ECL成像直接觀測電極的邊緣效應(yīng)。由于電極邊緣的非線性擴(kuò)散，在圓盤電極邊緣處成像出非均勻的電流密度^[3]。同年，該課題組報(bào)導(dǎo)了異質(zhì)結(jié)構(gòu)電極表面電化學(xué)活性的ECL直接成像^[4]。這是ECL成像首次應(yīng)用于電極電化學(xué)性能的表征。

1999年，Wightman課題組報(bào)導(dǎo)了在不同脈沖頻率下，電極表面ECL成像非均勻電流密度。通過調(diào)節(jié)脈沖寬度，在高曲率的位置可獲得更大的電流密度和可控的ECL光源^[5]。近年來，隨著成像設(shè)備的提升，ECL成像可深入單分子、單顆粒和單細(xì)胞層面，并獲得微納界面動(dòng)態(tài)信息。

2008年，Bard課題組在有機(jī)相中成像出單個(gè)25nm共軛聚合物納米粒子電子轉(zhuǎn)移過程中的動(dòng)態(tài)信息，開啟了單體電致化學(xué)發(fā)光成像的先河^[6]。法國波爾多大學(xué)Sojic課題組多年來一直致力于ECL成像與測量研究，他們報(bào)導(dǎo)了一種基于單個(gè)微米球的ECL反應(yīng)活性成像技術(shù)。這種3D成像方法提供了一種全新的模式用于ECL反應(yīng)機(jī)理研究及共反應(yīng)劑效能表征，對(duì)于篩選共反應(yīng)劑，提高分析靈敏度等方面都有著重要意義^[7]。

2018年，徐靜娟教授團(tuán)隊(duì)在60 nm單顆粒微納界面上開展電子傳遞和物質(zhì)遷移等過程的ECL成像。通過對(duì)異質(zhì)金屬雙面神（金-鉑結(jié)構(gòu)）界面電化學(xué)反應(yīng)的實(shí)時(shí)成像，測得異質(zhì)結(jié)構(gòu)納米材料具有更高的催化轉(zhuǎn)化效率及穩(wěn)定性^[8]。

2020年，浙江大學(xué)蘇彬教授報(bào)道了基于單晶分子線的電致化學(xué)發(fā)光波導(dǎo)，系統(tǒng)地研究了在電化學(xué)激發(fā)下，單個(gè)Ir(piq)3分子線的波導(dǎo)行為^[9]。
 

圖4：基于單晶分子線的波導(dǎo)電致化學(xué)發(fā)光
 

在單細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析方面，表面限域ECL成像^[10]、免標(biāo)記ECL成像^[11]、局部電勢調(diào)控的高靈敏ECL成像^[12]等也為精準(zhǔn)理解生命過程中的化學(xué)基礎(chǔ)提供了先進(jìn)的測量技術(shù)。然而，作為一種光學(xué)成像技術(shù)，ECLM受到衍射極限的影響，無法得到更精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息。因此，發(fā)展超分辨電致化學(xué)發(fā)光顯微鏡（Super-resolution ECLM）打破傳統(tǒng)衍射極限，對(duì)于單體層面、微納界面分析成像具有重要意義。

2021年，浙江大學(xué)馮建東研究員課題組在Nature發(fā)表了研究論文，發(fā)展了一種單分子ECL成像技術(shù)，對(duì)ECL中單個(gè)分子發(fā)射的單個(gè)光子的位置進(jìn)行成像^[13]，并使用極稀釋的溶液來確保這些分子在空間上分開。該技術(shù)用于空間高斯擬合后可以打破光學(xué)衍射極限，使其成像分辨率媲美超分辨率熒光顯微鏡。
 

圖5：活體細(xì)胞的單分子ECL成像

 

上海大學(xué)趙微教授與南京大學(xué)徐靜娟教授聯(lián)合在JACS報(bào)道了基于發(fā)光徑向漲落的超分辨成像（SRRF）的超分辨ECLM^[14]。通過連續(xù)采集寬場ECL圖像，并求解ECL信號(hào)漲落的徑向梯度變化實(shí)現(xiàn)超分辨成像。這種算法通過梯度收斂性逼近發(fā)光中心的真實(shí)位置，不需要特殊樣品及復(fù)雜裝置，且不需要數(shù)千幀的累計(jì)，在提高空間分辨率的同時(shí)，保持較高的時(shí)間分辨率，適用于動(dòng)態(tài)過程成像。

圖6：單顆粒ECL-SRRF成像示意圖

 

電致化學(xué)發(fā)光成像歷經(jīng)數(shù)十年發(fā)展，機(jī)遇與挑戰(zhàn)并存。設(shè)計(jì)并合成高量子產(chǎn)率的發(fā)光試劑，降低成像背景提高測量靈敏度，以及進(jìn)一步提升成像的空間與時(shí)間分辨率，是科研人員奮進(jìn)的方向。毫無疑問，這種成像技術(shù)的進(jìn)步會(huì)極大地推動(dòng)其在應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展，并幫助人們更多的了解科學(xué)和自然的本質(zhì)。

作為光學(xué)技術(shù)的先進(jìn)制造商，Evident秉承Olympus持續(xù)推動(dòng)最前沿科學(xué)技術(shù)進(jìn)步的承諾，為電化學(xué)發(fā)光成像研究提供優(yōu)秀的顯微成像設(shè)備，尤其是數(shù)值孔徑高達(dá)1.5和1.7的超高分辨物鏡，特別適合單分子或者單顆粒電化學(xué)發(fā)光的弱信號(hào)檢測。

從左到右：UPLXAPO40XO，數(shù)值孔徑1.4

UPLAPO60XOHR，數(shù)值孔徑1.5

UPLAPO100XOHR，數(shù)值孔徑1.5

APON100XHOTIRF，數(shù)值孔徑1.7
 

針對(duì)電化學(xué)發(fā)光成像原理及易受環(huán)境光干擾等應(yīng)用特點(diǎn)，我們推出了IXplore Live for Luminescence — 單細(xì)胞發(fā)光成像解決方案（點(diǎn)擊查看詳情）。該系統(tǒng)采用簡約箱體式設(shè)計(jì)，高效避光，配合EMCCD高靈敏檢測器，輕松實(shí)現(xiàn)高信噪比、高分辨率的發(fā)光成像。高穩(wěn)定性成像系統(tǒng)配合高適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，滿足各種樣品及應(yīng)用需求。
 

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