流式細(xì)胞術(shù)在CAR-T臨床研發(fā)前的應(yīng)用

嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，CAR-T)，是通過基因工程技術(shù)將自體或異體T細(xì)胞改造成針對(duì)腫瘤特異性抗原的新型殺傷細(xì)胞，該療法已經(jīng)在血液腫瘤的治療上取得了矚目的成效。CAR-T細(xì)胞免疫療法的臨床前研究，是成藥中關(guān)鍵且漫長的一步，包括了靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、抗體的開發(fā)、scFv篩選、CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建、CAR-T細(xì)胞體外抗腫瘤活性和CAR-T細(xì)胞體內(nèi)抗腫瘤活性評(píng)估等多個(gè)重要環(huán)節(jié)。

流式細(xì)胞術(shù)是一種可對(duì)懸浮于流體中的微小顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和分選的技術(shù)，由于其高效、簡便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞治療的各個(gè)環(huán)節(jié)。下面帶大家了解流式細(xì)胞術(shù)在CAR-T臨床研發(fā)前的應(yīng)用。

一、檢測靶點(diǎn)抗原的表達(dá)豐度
CAR-T細(xì)胞通過其scFv精準(zhǔn)識(shí)別腫瘤細(xì)胞上的抗原并發(fā)揮殺傷作用，因此篩選理想的靶點(diǎn)抗原是一個(gè)重要的步驟。篩選高特異性的靶點(diǎn)抗原，需要檢測靶點(diǎn)抗原在所有細(xì)胞中的表達(dá)豐度，篩選到在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)且在正常細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)的抗原，以此盡可能避免CAR-T細(xì)胞療法的毒副作用。流式細(xì)胞術(shù)在這個(gè)過程中有重要的應(yīng)用。比如下面的報(bào)道中，作者通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了靶點(diǎn)抗原BCMA的分布情況，發(fā)現(xiàn)BCMA在正常和腫瘤PC細(xì)胞上均高表達(dá)。而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。
 

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測靶點(diǎn)抗原的表達(dá)豐度^[1]

二、病毒滴度檢測
CAR-T臨床研發(fā)前需要構(gòu)建CAR-T細(xì)胞和抗原過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞模型，用于后續(xù)評(píng)估CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤能力。一般而言，通過能夠編碼目的序列的慢病毒來侵染對(duì)應(yīng)的細(xì)胞系，可高效構(gòu)建上述的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型。在這個(gè)過程中，慢病毒的滴度是受到嚴(yán)格質(zhì)控的。流式細(xì)胞術(shù)是其中一種檢測慢病毒活性滴度的重要手段。下面以一個(gè)實(shí)例介紹流式細(xì)胞術(shù)在慢病毒滴度檢測方面的應(yīng)用：

我們需要檢測CD19抗原慢病毒的滴度，將能編碼CD19抗原的慢病毒純化液以0.01、0.1、1、10μl四個(gè)梯度分別加入到事先接種的293T細(xì)胞中，72小時(shí)后流式檢測293T細(xì)胞CD19抗原的陽性率（即被慢病毒感染的293T細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比），進(jìn)而按如下公式計(jì)算慢病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度：
 

A：表示0.1μl組陽性細(xì)胞占比
B：表示0.01μl組陽性細(xì)胞占比
N：加入病毒時(shí)候細(xì)胞數(shù)量
V：表示A組中病毒的加入體積
 

圖2 CD19抗原慢病毒滴度檢測結(jié)果

（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

如圖所示，CD19抗原陽性細(xì)胞的數(shù)量隨轉(zhuǎn)染病毒梯度的增加而逐漸升高，表明該慢病毒有良好的感染活性，并按上述公式計(jì)算病毒滴度為：1.4×10⁸Tu/ml。

同樣地，采用上述方法檢測CD19 CAR慢病毒滴度，經(jīng)計(jì)算后得到病毒滴度約為：4.33×10⁸Tu/ml。
 

圖3 FMC63 CAR慢病毒滴度檢測結(jié)果

（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

三、CAR-T細(xì)胞表型分析以及CAR陽性率（或過表達(dá)抗原細(xì)胞模型的抗原陽性率）
對(duì)于構(gòu)建好的CAR-T細(xì)胞，在進(jìn)行功能驗(yàn)證前需要檢測其表型和CAR分子的陽性率。流式細(xì)胞術(shù)可有效檢測CAR-T細(xì)胞表面的標(biāo)志蛋白和CAR分子的陽性率。同理，對(duì)于構(gòu)建的過表達(dá)抗原細(xì)胞模型，也可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測抗原表達(dá)情況。下面通過實(shí)例進(jìn)行介紹。

▶ 檢測T細(xì)胞的表型及CD19 CAR-T細(xì)胞陽性率陽性率
對(duì)兩種方法制備T細(xì)胞用抗體標(biāo)記后表型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩種方法均能獲得高純度的T細(xì)胞，但二者擴(kuò)增出來的不同亞型T細(xì)胞的占比有較大的差異，Method1擴(kuò)增出來的T細(xì)胞以CD8+T細(xì)胞亞型為主，而Method2可擴(kuò)增出CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞占比差異較小的T細(xì)胞群體，這兩種方法為研究不同亞型T細(xì)胞的作用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。同時(shí)，我們用CD19 CAR慢病毒轉(zhuǎn)染Method1擴(kuò)增出來的T細(xì)胞，構(gòu)建CD19 CAR-T細(xì)胞，并使用流式法檢測CAR蛋白的表達(dá)效率，結(jié)果顯示CD19 CAR-T的陽性率可達(dá)到45.59%，表明我們成功構(gòu)建了CD19 CAR-T細(xì)胞。
 

圖4 T細(xì)胞表型分析及FMC63 CAR-T細(xì)胞陽性率檢測。A.PBMC活化擴(kuò)增第十天T細(xì)胞占比及表型分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。B.FMC63 CAR-T細(xì)胞CAR陽性率檢測結(jié)果。（數(shù)據(jù)來源：賽業(yè)生物）

▶ 質(zhì)控CD19-293T細(xì)胞株構(gòu)建
通過CD19慢病毒感染293T細(xì)胞，構(gòu)建CD19穩(wěn)定表達(dá)的293T細(xì)胞株，并采用流式檢測其抗原CD19的高表達(dá)。
 

四、體外檢測CD19 CAR-T細(xì)胞的殺傷效果
將CAR-T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞或構(gòu)建的抗原過表達(dá)細(xì)胞模型混合，檢測腫瘤細(xì)胞或抗原過表達(dá)細(xì)胞模型的死亡，可反映CAR-T細(xì)胞殺傷效果。其中，通過流式細(xì)胞術(shù)可檢測腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。如下面的這個(gè)實(shí)例：

將CD19 CAR-T細(xì)胞和T細(xì)胞分別以不同效靶比同Nalm6細(xì)胞共孵育48h，隨后流式法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡。如圖所示，與T細(xì)胞組相比，不同效靶比條件下，CD19 CAR-T細(xì)胞均展現(xiàn)出了對(duì)Nalm6細(xì)胞明顯增強(qiáng)的特異性細(xì)胞毒性作用。同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子含量檢測結(jié)果也顯示，同腫瘤細(xì)胞共孵育后CD19 CAR-T細(xì)胞因子IFN-γ分泌量相比于T細(xì)胞具有顯著的增強(qiáng)。
 

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參考文獻(xiàn)：
Bu DX, Singh R, Choi EE, et al. Pre-clinical validation of B cell maturation antigen (BCMA) as a target for T cell immunotherapy of multiple myeloma. Oncotarget. 2018;9(40):25764-25780.