結(jié)構(gòu)改造黃原稀染料體系實現(xiàn)大于1300 nm NIR-II血管造影

本文要點：近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ）窗口的熒光生物成像可以提供具有低背景信號的精確圖像。根據(jù)單體的固有發(fā)射，實現(xiàn)有機熒光團的吸收/發(fā)射波長超過1300 nm是具有挑戰(zhàn)性的工作。減少聚集熒光淬滅（ACQ）效應(yīng)是在理想?yún)^(qū)域?qū)崿F(xiàn)熒光生物成像的有效策略。本文報道了兩個在相同骨架上具有不同側(cè)鏈的NIR-Ⅱ氧雜蒽熒光團（CM1和CM2），及其相應(yīng)的組件CM1 NPs和CM2 NPs。其中CM2 NPs顯示出ACQ效應(yīng)的顯著降低，最大吸收/發(fā)射波長拓展至1235/1250 nm。CM2 NPs可以高分辨率區(qū)分鄰近的動脈與靜脈，并且可以實現(xiàn)超過1300 nm的血管造影，分辨小至0.23 mm的毛細血管。
 

---

近紅外二區(qū)（NIR-Ⅱ，1000 -1700 nm）窗口的熒光生物成像具有高靈敏度、深穿透深度（~ 1.5 cm）和高成像質(zhì)量與對比度等優(yōu)良性質(zhì),近幾年得到飛速發(fā)展。開發(fā)具有足夠亮度的NIR-Ⅱ熒光團對于更先進的NIR-Ⅱ生物成像至關(guān)重要。目前已開發(fā)的NIR-Ⅱ有機熒光團主要包括聚亞甲基、苯并噻二唑衍生物、氧雜蒽衍生物、BODIPY衍生物等。廣泛拓展π共軛結(jié)是將吸收/發(fā)射波長紅移到NIR-Ⅱ窗口的一種有效策略，但由此帶來了結(jié)構(gòu)優(yōu)化的挑戰(zhàn)。1）長波長熒光燃料由于其最高占據(jù)分子軌道（HOMO）能級高而通常不穩(wěn)定且易被氧化。2）由于其表面疏水性，大的π共軛染料容易形成H-聚集體和遭受ACQ效應(yīng)。因此，該策略并不適用于通過靜脈注射進行明亮精細的熒光成像。為了減少H-聚集體導(dǎo)致的ACQ效應(yīng)，J-聚集體和聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）物質(zhì)被廣泛使用。然而，這些策略仍受到復(fù)雜的制備過程和低于1200 nm的本征發(fā)射的限制。

本文合成了兩個在相同骨架上具有不同側(cè)鏈的NIR-Ⅱ氧雜蒽染料（CM1和CM2），采用兩親聚合物F127封裝它們來制備水分散的納米粒子，再通過經(jīng)典乳化方法制備了兩個組件CM1 NPs和CM2 NPs。CM1 NPs顯示出明顯的ACQ效應(yīng)且熒光較弱，而CM2 NPs表現(xiàn)出降低的ACQ效應(yīng)及明亮的熒光，且最大吸收/發(fā)射波長擴展到1235/1350 nm。靜脈注射CM2 NPs后可以觀察到明亮的后肢脈管系統(tǒng)，甚至可以區(qū)分鄰近的動脈和靜脈。此外，具有低背景信號的CM2 NPs可實現(xiàn)超過1300 nm的血管造影。（Figure 1）

Figure 1

 

作者首先完成了CM1和CM2分子的制備及表征。通過將兩個氧雜蒽核與花青染料橋聯(lián)得到NIR-Ⅱ氧雜蒽染料核心CL1，隨后CL1與硫醇進行經(jīng)典親核取代反應(yīng)合成CM1和CM2（CM1 : 3,5 -雙（三氟甲基）苯硫醇；CM2 ：2- （4-巰基對苯基）乙酸）（Figure 2a）。隨后對其光物理性質(zhì)進行了考察。CM1和CM2在NIR-Ⅱ區(qū)域都表現(xiàn)出較長的吸收/發(fā)射波長，在氯仿中的最大吸收/發(fā)射波長分別為1180/1220 nm和1160/1200 nm；CM1和CM2的摩爾吸光系數(shù)分別約為26800和31300 M-1cm-1，計算出CM1和CM2的熒光量子產(chǎn)率為0.70 × 10-4和0.76 × 10-4（Figure 2b和Table 1）。作者還以市售的吲哚菁綠（ICG）和IR 1061染料為參考，對CM1 NPs和CM2 NPs的光穩(wěn)定性進行了探索，由于分子剛性更大，CM1和CM2在1064 nm照射下的光穩(wěn)定性與IR 1061相當，而ICG在808 nm的光照射下迅速漂白（Figure 2c）。

Figure 2

 

Table 1

作者接著完成了CM1 NPs 和CM2 NPs的制備并對其表征。采用兩親聚合物F127包封CM1和CM2賦予染料用于靜脈注射的親水性，采用經(jīng)典乳化方法制備兩種水分散的納米顆粒CM1 NPs 和CM2 NPs（Figure 3a）。由透射電子顯微鏡（TEM）圖像得到其平均納米顆粒尺寸為50和30 nm，由動態(tài)光散射（DLS）得到其流體動力學(xué)尺寸為126和100 nm（Figure 3b和c），流體動力學(xué)尺寸略大于TEM中的顆粒尺寸來源于水化層的包裹。此外，CM1 NPs 和CM2 NPs在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清（FBS）中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。作者進一步檢查它們的吸收和發(fā)射光譜發(fā)現(xiàn)，CM1 NPs表現(xiàn)出典型的H-聚集現(xiàn)象，最大吸收波長為790 nm（Figure 3d），猜測CM1 NPs的弱熒光強度來源于由H-聚集體導(dǎo)致的ACQ效應(yīng)，與之相反，由于ACQ效應(yīng)的顯著降低，CM2 NPs比CM1 NPs表現(xiàn)出更高的熒光強度，最大吸收波長為1235/1250 nm（Figure 3e）。作者計算出，分散在水中的CM1 NPs和CM2 NPs的熒光量子產(chǎn)率分別為0.01 × 10-4和0.15 × 10-4。通過體外NIR-Ⅱ熒光成像，作者發(fā)現(xiàn)CM2 NPs通過1150和1300長通（LP）過濾器表現(xiàn)出明顯的熒光信號，而CM1 NPs則幾乎沒有熒光信號。此外，CM2 NPs在pH 4-9范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的pH穩(wěn)定性。由此可見，CM2 NPs可用于1300 nm以上的NIR-Ⅱ熒光成像。

Figure 3

 

作者接著對CM2 NPs減少ACQ效應(yīng)的機制進行探究。首先借助MD模擬來幫助理解分子間堆疊方式降低ACQ效應(yīng)的機制（Figure 4a），如Figure 4b（側(cè)視圖）和4c（頂視圖）所示，CM2表現(xiàn)出高度扭曲的行為，避免了形成具有龐大平面結(jié)構(gòu)的H-聚集體。將CM2分成三個部分來測量兩個相鄰分子的分子間距離，如Figure 4b所示，CM2的巰基部分命名為1，兩點的氧雜蒽核分別命名為2和3，相鄰分子的相應(yīng)三個部分分別命名為1’、2’和3’。如Figure 4d所示，兩個相鄰的CM2分子的羧基在2.8 Å的距離處形成氫鍵。兩個相鄰分子的秋季垂直距離為3.5 Å，滑動角為46.8°。兩個相鄰CM2分子的氧雜蒽核2與2’間的垂直距離為4.0 Å，滑動角為46.7°，表現(xiàn)為π-π折疊行為（Figure 4e）。值得注意的是，這兩個部分的滑動角幾乎相等，均小于J-聚集體的臨界值54.7°。而如Figure 4f所示，兩個相鄰CM2分子的氧雜蒽核3與3’之間的垂直距離為3.7 Å，呈邊對面堆疊方式。這種典型的CH-π相互作用有助于形成更穩(wěn)定的組裝體并延長體內(nèi)循環(huán)。作者由此提出，側(cè)鏈工程驅(qū)動的氫鍵、π-π相互作用及CH-π相互作用降低了CM2的ACQ效應(yīng)。

 

作為比較，作者還通過MD模擬探索了CM1 NPs的分子間堆疊方式，證實了CM1的H-聚集行為，解釋了CM1 NPs表現(xiàn)出顯著的ACQ效應(yīng)的原因。
 

Figure 4

 

作者繼續(xù)考察了CM1 NPs和CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影性能。將CM1 NPs或CM2 NPs（100 μl， 1 mg/ml）靜脈注射到小鼠體內(nèi)進行后肢血管造影。作者采用1150 LP濾光片截止小于1150 nm的發(fā)射，從而盡可能長時間地探索它們在NIR-Ⅱ的成像能力。如Figure 5a所示，CM2 NPs的高熒光強度使得在使用1150 LP的濾光片情況下，仍可以區(qū)分明亮精確的血管。而靜脈注射CM1 NPs后則沒有觀察到明顯的血管。在Figure 5a中標記橫截面線1和2，通過高斯擬合曲線，可得截面線（1）處的血管半峰全寬（FWHM）分別為0.40、0.38和0.37（Figure 5b），而截面線（2）處的血管FWEM分別為0.47、0.50和0.28（Figure 5c）。由此可見，CM2 NPs的高分辨率成像足以成功區(qū)分鄰近的動脈和靜脈，表明了其更好的NIR-Ⅱ血管造影性能。此外，CM1 NPs和CM2 NPs均通過肝膽系統(tǒng)代謝出體外。

 

隨后作者研究了商業(yè)染料ICG及IR 1061的血管成像能力，以進行對比。由于808 nm激光的穿透深度及ICG在NIR-Ⅱ窗口的低亮度，靜脈注射ICG后無法清楚區(qū)分后肢脈管系統(tǒng)（Figure 5d）。與之類似，由于嚴重的熒光淬滅效應(yīng)，IR 1061在980 nm或1064 nm激發(fā)下靜脈注射后幾乎無熒光信號被收集到。
 

Figure 5

 

作者最后探索了CM2 NPs超過1300 nm的NIR-Ⅱ血管造影性能。由于CM2 NPs在800 – 1400 nm的范圍內(nèi)顯示出寬吸收波長，作者首先在808、980和1064 nm處分別探索了CM2 NPs在不同波長激發(fā)下的血管成像能力。如Figure 6a所示，采用1150 LP濾波器，CM2 NPs在1064 nm波長激發(fā)下的血管圖像比在808和980 nm波長激發(fā)下更亮。且在1064 nm波長的高亮度下，可用0.39和0.41 mm的FWEM區(qū)分鄰近的動脈與靜脈（Figure 6b）。但無法在808和980 nm波長激發(fā)下的血管圖像識別鄰近的動脈與靜脈（Figure 6b）。

 

作者進一步將CM2 NPs應(yīng)用于1064 nm激發(fā)下超過1300 nm的血管造影。如Figure 6c所示，采用1300 LP的濾光片的血管成像具有比1150 LP濾光片更低的背景信號。橫截面線（6）處血管的FWEM分別為0.63和0.52 mm，信號背景比（SBR）為1.27，橫截面線（7）處血管的FWEM分別為0.58和0.48 mm，SBR為1.33（Figure 6d）。更出色的是，橫截面線（8）處的血管FWEM分別為0.33和0.23 mm，SBR為1.14（Figure 6d），表明1300 LP濾光片的血管成像可以實現(xiàn)毛細血管的區(qū)分。由此可知，CM2 NPs能以高分辨率實現(xiàn)對超過1300 nm的血管成像。

 

得益于1300 nm的高分辨成像，可通過使用超過1300 nm的成像平臺區(qū)分不同類型的血管。CM2 NPs的熒光光譜中超過1300 nm的更多發(fā)射部分可有效應(yīng)用于血管成像。而CM1 NPs只有很小的尾峰發(fā)射部分可以達到1300 nm，這對于1300 nm以上的高效成像是不夠的。作者隨即考察了CM2 NPs在小鼠體內(nèi)的毒性，以健康小鼠為對照。血常規(guī)指標、血清生化指標以及主要器官的H&E染色圖像的結(jié)果顯示，CM2 NPs可用作安全的熒光體內(nèi)顯像劑。
 

Figure 6

 

總結(jié)：作者合成了兩種帶有不同側(cè)鏈的氧雜蒽染料（CM1和CM2），它們表現(xiàn)出NIR-Ⅱ激發(fā)特征、相似的光物理性質(zhì)和良好的穩(wěn)定性。通過將染料包封在F127中制備相應(yīng)的納米粒子，CM2 NPs顯著克服了ACQ效應(yīng)而CM1 NPs沒有，且CM2 NPs表現(xiàn)出高亮度的高效NIR-Ⅱ發(fā)射。作者提出減少CM2的ACQ效應(yīng)的機制為多重相互作用即分子間氫鍵、π-π相互作用和CH-π相互作用。CM2 NPs的NIR-Ⅱ血管造影顯示出高亮度與對比度。與NIR-Ⅰ在808 或980 nm激發(fā)下相比，CM2 NPs在1064 nm的NIR-Ⅱ激發(fā)下的圖像具有更高的分辨率，可以區(qū)分鄰近的動脈和靜脈。此外，CM2 NPs能夠以低背景信號實現(xiàn)超過1300 nm的血管造影，甚至可以分辨小至0.23 mm的毛細血管。CM2 NPs同時滿足體內(nèi)熒光團的必需條件，對小鼠具有良好的生物安全性。這種由側(cè)鏈工程驅(qū)動的具有降低ACQ效應(yīng)的新型NIR-Ⅱ氧雜蒽染料極大地拓展了未來NIR-Ⅱ高分辨率生物成像的臨床應(yīng)用。

 

參考文獻

doi.org/10.1016/j.bios.2022.114701

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴展X射線輻照、熒光壽命、一區(qū)熒光成像、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng)，兼容成像型光譜儀

 

 

⭐️ ⭐️ ⭐️

 

 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司，專注于近紅外二區(qū)成像技術(shù)。致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供先進的、一體化的成像解決方案。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

          與基于可見光波長的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線、紫外、紅外、短波紅外、太赫茲范圍，可為腫瘤學(xué)、神經(jīng)學(xué)、心血管、藥代動力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果，助力科技研發(fā)。

          同時，恒光智影還具備探針研發(fā)能力，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過15種探針，這些探針將廣泛地應(yīng)用于眾多生物科技前沿領(lǐng)域的相關(guān)研究中。