單細胞分析揭示C1q-high單核細胞對貝赫切特病的促炎作用

貝赫切特�。˙ehcet’s disease，BD），又名白塞病，是一種慢性血管炎，通常表現(xiàn)為復發(fā)性口腔/生殖器潰瘍和皮膚病變，以全身免疫異常為特征。然而，目前還缺乏對BD發(fā)病機制的全面了解。研究者對BD患者和健康供血者的外周血單個核的細胞(PBMCs) 進行了單細胞測序和Bulk RNA測序并對分離出的單核細胞進行了單細胞測序。研究者觀察到BD患者外周血單個核的細胞中單核細胞不僅在數量上會顯著增加而且細胞內部也存在明顯的轉錄變化。數據分析顯示，BD中C1q-high單核細胞(C1qhi)顯著富集；擬時序分析表明，BD單核細胞明顯地將其分化向伴隨炎癥和C1qhi單核細胞的軌跡轉移。進一步的實驗表明，C1qhi單核細胞可增強吞噬和促炎細胞因子分泌，并且該亞型具有顯著的臨床相關性。在機制上，激活的干擾素-γ (IFN-γ)信號在BD患者中誘導C1qhi單核細胞增多，而tofacitinib治療可使C1qhi單核細胞減少。該研究闡明了BD的免疫情況和C1qhi單核細胞對BD炎癥增加的重要性，這使它們可作為治療靶點和疾病的臨床評估指標。

 

文章題目：Single-cell analyses highlight the proinflammatory contribution of C1q-high monocytes to Behcet’s disease

中文題目：單細胞分析揭示了C1q-high單核細胞對貝赫切特病的促炎作用

見刊時間：2022.06

期刊名稱：PNAS

影響因子：12.779

實驗平臺：scRNA-seq (10X Genomics)

DOI：10.1073/pnas.2204289119

 

研究內容

1、BD中外周血單個核細胞的單細胞測序情況

研究者對4例未接受治療的BD患者和4例健康對照人(HCs)的PBMCs進行了單細胞測序(圖1A)。共檢測出36190個高質量的細胞，并從5個主要細胞系中的得到了20個細胞群(圖1B)，包括髓系細胞(CD33+)、T細胞(CD3D+)、自然殺傷細胞(NK) (KLRF1+)、B細胞(CD79A+)和非免疫細胞系(PPBP+)(圖1C，1D)。研究者進一步進行了細胞亞群分析：確定了四種髓系細胞亞型 (圖1E)，包括CD14+單核細胞(LYZ+CD14+)，CD16+單核細胞(LYZ+FCGR3A+)，常規(guī)樹突狀細胞(cDCs;CD1C+CLEC10A+)，漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs;LILRA4 + CLEC4C +)；8種T細胞亞型，即新生的CD4 T細胞(CD4 T naive;CD3D+ CCR7+)，記憶CD4 T細胞(CD4 Tmemory;CD3D+ CD40LG+)，IFN相關的CD4 T細胞(CD4 T與IFN相關;CD3D+ ISG15+)、調節(jié)性T細胞(Tregs;CD3D+ FOXP3+)，先天性的T細胞(先天性淋巴細胞;CD3D+ CD127+ KLRG1+ SLC4A10+)，記憶CD8 T細胞(CD8 Tmemory;CD8A+ GZMK+)，效應CD8 T細胞(CD8 Teffector;CD8A+ GZMB+)、增殖T細胞(增殖T;CD3D+ MKI67+)。

圖1. BD患者和健康供體外周血單個核細胞的單細胞測序圖譜

 

2、單核細胞參與BD的系統(tǒng)免疫畸變

研究者整合了scRNA-seq(4例BD患者和4例HCs)與Bulk RNA-seq(9例BD患者和10例HCs)的數據。從Bulk RNA-seq數據中研究者鑒定出了BD中有1,514個上調和325個下調的差異表達基因(DEGs)(圖2A)。他們將這些DEGs與scRNA-seq數據中確定的細胞類型進行映射，并發(fā)現(xiàn)上調的DEGs在單核細胞和DCs中相對富集(圖2B)，而下調的基因在B細胞中富集(圖2C)。研究者們還發(fā)現(xiàn)：BD患者單核細胞比例高于HCs(圖2D)，全血細胞計數數據也進一步證實了這一點(圖2E)，這表明單核細胞在BD中起著重要的作用。隨后，研究者使用scRNA-seq數據研究了主要細胞系中與BD進展相關的生物學途徑。在單核細胞中，最主要的途徑是IFN-γ反應、外源性抗原的加工和遞呈以及中性粒細胞的激活(圖2F和G)。

圖2. BD患者PBMCs中的單核細胞異常

 

3、單核細胞異質性的鑒定

接下來研究者對4名BD患者和4名HCs的PBMCs進行磁珠分選單核細胞(CD14+)，并進行了scRNA-seq。共得到39385個高質量的單核細胞，進一步分析得到了8個細胞群 (圖3A)。然后，研究者通過評估高表達基因和相應的富集通路來比較單核細胞所有8個亞型的功能表型(圖3B)。8個單核細胞亞型中有5個存在CD14高表達(圖3C)。在CD14低表達的3個亞型中，CD16 high單核細胞(CD16 Monos)呈現(xiàn)非經典單核細胞標記物(FCGR3A、MS4A7和CX3CR1)，單核細胞來源的DC (MoDCs)呈現(xiàn)過表達抗原遞呈途徑和DC特異性基因標記物 (CLEC10A、FCER1A、CST3和CD74)。C1qhi單核細胞(C1Q Monos)高表達補體1q (C1Q基因，包括C1QA、C1QB和C1QC)和巨噬細胞標志物(CD68)(圖3C)。接下來，研究者研究了與BD相關的單核細胞組成的差異。對比BD組和HC組的相對細胞比例，他們觀察到BD患者C1Q Monos明顯增加，MoDCs明顯減少(圖3D)。通過流式細胞術，他們觀察到該亞型的存在，并驗證了BD患者的C1Q單核細胞數量(scRNA-seq數據中的C1Q單核細胞數量)增加(圖3E、F)。

圖3. BD中單核細胞的異質性

 

4、向C1qhi單核細胞分化的軌跡伴隨著炎癥

為了探索單核細胞亞型之間的軌跡關系，研究者又做了細胞軌跡分析。擬時序軌跡軸從MHC-II Monos分叉為兩個末端:fate 1, C1Q Monos和fate 2, MoDCs(圖4A和B)。但這兩種分布顯著不平衡，BD單核細胞在命運1末端聚集，而HC單核細胞在命運2末端聚集(圖4C)。這一結果與BD中C1Q單核細胞增多和MoDCs信號減少相對應(圖3D)。研究者又研究了兩種分化軌跡下的相關基因表達譜和通路。結果顯示：編碼炎癥細胞因子相關蛋白的基因(ISG15、TNFRSF1B和S100A11)和補體成分(C1q基因)沿著fate 1逐漸上調(圖4D)。相反，fate 2顯示出抗原呈遞基因的變異，包括MHC-II基因(HLA-DR、HLA-DP和HLA-DQ)、免疫球蛋白E受體Fc片段(FCER1A和FCER2B)和DC標記(CLEC10A、CD1C和CD74)(圖4E)。途徑富集分析發(fā)現(xiàn)，fate 1與炎癥相關通路相關，如趨化因子信號通路、核苷酸寡聚化域(NOD)樣受體信號通路和NK細胞介導的細胞毒性，而fate 2與抗原呈遞相關通路相關。參與單核細胞-巨噬細胞轉化(RHOC, NR4A1和MAFB)的轉錄因子(TFs)的表達在fate 1中逐漸增加，最終形成巨噬細胞樣亞型(C1Q Monos)，但在fate 2中沒有，最終形成MoDCs亞型(圖4G)。

圖4. 單核細胞亞型的分化軌跡

 

5、C1Q單核細胞參與BD的高炎癥反應

為了測試C1Q單核細胞是否具有促炎特性，研究者分析了單核細胞的三個關鍵炎癥調節(jié)能力，包括吞噬、抗原呈遞和細胞因子分泌。C1Q單核細胞比其他亞型具有更大的功能(圖5A)，這是由BD相關的促炎細胞因子(TNF和IL6)、FcR激活因子(LYN和HCK)、細胞骨架重塑因子(PIK3CG、WASP2和VASP)和MHC-II成分的過表達引起。接下來，研究者檢測了單核細胞的吞噬能力。結果表明：BD C1qhi單核細胞比CD16+單核細胞和CD16單核細胞吞噬更多右旋糖酐（圖5 B、C）。他們進一步檢測了脂多糖(LPS)刺激的單核細胞中促炎細胞因子的產生情況，并觀察到BD C1qhi單核細胞產生的IL-6和TNF-α水平顯著高于CD16+單核細胞或CD16－單核細胞（圖5 D-G）。

圖5. C1qhi單核細胞表現(xiàn)出促炎的特性

 

6、激活的IFN-γ信號刺激了BD中C1qhi單核細胞的擴增

為了了解BD中C1qhi單核細胞擴增的潛在機制，研究者首先分析了BD和HC之間C1qhi單核細胞的DEGs，并確定了BD中254個上調基因和115個下調基因。上調的基因在IFN-γ應答通路中顯著富集(圖6A)。接下來，研究者做了SCENIC分析，并注意到調節(jié)IFN-γ反應途徑的轉錄因子（Transcription Factor，TF）的顯著富集，包括STAT1和IRF1(圖6B)，這些TF的表達也在BD患者的C1qhi單核細胞中升高。STAT1磷酸化被證實在BD患者的C1qhi單核細胞中顯著增加（圖6 C）。IFN-γ處理也可顯著增加HC單核細胞中C1q基因的表達(圖6D)并且可以增加C1qhi單核細胞比例(圖6E、F)。

圖6. IFN-γ水平的增加導致了BD中C1qhi單核細胞的擴增

 

7、C1qhi單核細胞將BD患者與健康供體區(qū)分開來，并對治療有反應

為了探索C1Q Monos的潛在臨床價值，研究者在他們自己的內部隊列(n = 19)和三個已發(fā)表的BD患者活躍隊列(GSE17114, n = 29；GSE165254, n = 25；GSE70403, n = 58)中挖掘了C1Q Monos高表達基因的預測能力。在三個隊列中，C1Q Monos中表達最多的5個基因顯著解釋了方差，并預測了曲線下面積大于0.7的BD患者(圖7A)。因此，C1Q Monos可以在不同的隊列中區(qū)分BD患者和HC。研究者又調查了通過單核細胞亞型全基因組關聯(lián)研究確定的BD相關基因，發(fā)現(xiàn)這些基因在C1Q Monos中具有最高平均表達水平。此外，C1qhi單核細胞與紅細胞沉降率(衡量BD炎癥程度的臨床診斷參數)呈正相關(結果在補充圖，此處未列出)，在疾病活動度評分高的BD患者中所占比例更高(圖7B)。總之，這些結果揭示了C1qhi單核細胞與疾病的顯著相關性。

此外，研究者還探討了BD患者的C1qhi單核細胞是否對藥物治療有反應，研究表明：免疫抑制治療顯著降低了同一患者的C1qhi單核細胞(圖7 C)。他們接下來測試了C1qhi單核細胞是否對tofacitinib有反應，研究表明：tofacitinib治療顯著降低了IFN-γ刺激的C1qhi單核細胞的轉錄水平(圖7D)和蛋白質水平(圖7E)。以上結果為C1qhi單核細胞在監(jiān)測治療效果方面的潛力提供了見解，并表明靶向C1qhi單核細胞可能是BD治療的有效策略。

圖7. C1qhi單核細胞區(qū)分了BD患者和HCs，并對BD治療有反應

 

主要結論

研究者對BD患者和HCs的PBMCs進行了單細胞測序和Bulk RNA測序，測序數據整合發(fā)現(xiàn)單核細胞變化顯著。隨后，研究者對BD患者和HC的PBMCs進行磁珠分選單核細胞并進行了單細胞測序，發(fā)現(xiàn)BD患者中C1qhi單核細胞明顯增多。并且發(fā)現(xiàn)C1Q單核細胞具有促炎特性，且BD中C1qhi單核細胞的擴增是由于IFN-γ水平的增加。在tofacitinib治療BD患者之后，C1qhi單核細胞會減少。此研究確定了C1qhi單核細胞在BD中的促炎作用，這些數據揭示了BD靶向治療和臨床評估的潛在靶點。

 

四.參考文獻

Zheng W, Wang X, Liu J, Yu X, Li L, Wang H, Yu J, Pei X, Li C, Wang Z, Zhang M, Zeng X, Zhang F, Wang C, Chen H, Chen HZ. Single-cell analyses highlight the proinflammatory contribution of C1q-high monocytes to Behçet's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Jun 28;119(26):e2204289119. doi: 10.1073/pnas.2204289119. Epub 2022 Jun 21. PMID: 35727985; PMCID: PMC9245671.