熒光定量PCR基礎(chǔ)知識(shí)小課堂（一）
01 常規(guī)PCR和熒光定量PCR的區(qū)別是什么呢？
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)：一種對(duì)特定的靶核酸片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。通常由變性—退火—延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，通過(guò)不同溫度的循環(huán)實(shí)現(xiàn)靶核酸的擴(kuò)增。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time qPCR) 是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸/基因檢測(cè)技術(shù)，是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針或熒光染料，通過(guò)采集熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序以及強(qiáng)弱的變化，搭配軟件分析Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)目的基因進(jìn)行定性或定量分析的方法。
02 熒光定量PCR反應(yīng)體系的組成都有什么呢？
熒光定量PCR反應(yīng)體系包括：核酸模板、引物、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、四種dNTP、熒光染料或Taqman探針以及含有Mg2+ 等的緩沖液。一般配置20μL或50μL體積的反應(yīng)體系。
核酸模板
通常配置20 μL反應(yīng)體系時(shí)，模板的使用量小于100 ng，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板時(shí)，模板量不超過(guò)體系終體積的20%。模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，常用于基因表達(dá)的檢測(cè)，在材料收集過(guò)程中，樣本需要立刻液氮速凍，并迅速轉(zhuǎn)移到超低溫冰箱保存，盡量避免RNA的降解。一般將實(shí)驗(yàn)材料分為對(duì)照組和處理組，組內(nèi)要有3組以上重復(fù)，以便后續(xù)對(duì)偏差較大的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。
DNA聚合酶
在進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要選擇合適的耐熱聚合酶，具體需參考酶的特異性、保真性、耐熱性、擴(kuò)增速率等多個(gè)指標(biāo)。目前市面上較常用的是Taq DNA聚合酶，其他還有Vent系列、KOD系列、Pfu系列等多種類(lèi)型的DNA聚合酶。
引物
是指人工合成的兩段寡核苷酸序列，其中一個(gè)引物與對(duì)應(yīng)的DNA模板鏈目標(biāo)區(qū)域3’端的堿基互補(bǔ)，另一個(gè)引物與另一條DNA模板鏈目標(biāo)區(qū)域5’端的堿基互補(bǔ)。
脫氧核苷三磷酸（dNTP）
dNTPs是dATP、dGTP、dTTP、dCTP的統(tǒng)稱(chēng)。dNTPs作為DNA復(fù)制原料，它直接影響擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量、特異性以及保真性，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要選擇濃度準(zhǔn)確、純度高的試劑。
緩沖液
緩沖液的作用是為DNA聚合酶活性提供適宜的化學(xué)環(huán)境。通常緩沖液的pH為8.0-9.5，改變pH會(huì)影響核酸擴(kuò)增量。另外緩沖液的關(guān)鍵組分Mg2+是酶工作所必需的離子，與 dNTPs 和模板螯合在一起，成為 DNA 聚合酶識(shí)別的底物。目前市面上的常用的緩沖液一般是2×的濃縮液，按照說(shuō)明書(shū)的添加量配置即可。
熒光團(tuán)基
熒光化學(xué)物質(zhì)可分為：熒光染料和熒光探針。
熒光染料以SYBR Green為代表，與DNA小溝區(qū)域非特異性結(jié)合，每形成一條雙鏈，就有染料與雙鏈DNA結(jié)合。通過(guò)光源激發(fā)染料產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)強(qiáng)弱與DNA雙鏈數(shù)量成正比。
熒光探針的發(fā)光機(jī)制與染料不同，利用的是一對(duì)能產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基團(tuán)，即5′端的報(bào)告基團(tuán)和3′端的淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所淬滅，擴(kuò)增時(shí)，5'端外切酶活性將探針?biāo)馇懈�，�?bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)開(kāi)始積累。
總的來(lái)說(shuō)，熒光定量PCR作為核酸定量常用的檢測(cè)方法，體系配置簡(jiǎn)單，適用范圍廣泛。在進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，不管是選擇熒光染料還是熒光探針，檢測(cè)方法都很有效，可以根據(jù)本身材料情況，選擇適合的方法。
Esan-Gene 162/164
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