3D組織成像的挑戰(zhàn)與解決方案：快速預(yù)覽到高分辨率成像的一鍵切換
全場景顯微成像分析平臺MICA集3D采集和AI定量于一體。
3D組織成像廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。研究人員利用它來揭示組織組成和完整性的詳細(xì)信息，或從實驗操作中得出結(jié)論，或比較健康與不健康的樣本。本文介紹了MICA如何幫助研究人員進行3D組織成像。
3D組織成像
模式生物或患者的組織切片可用于分析從組織到細(xì)胞的各種形態(tài)，進而發(fā)現(xiàn)健康和非健康樣本以及對照樣品和實驗樣品之間的差異。例如，是否存在特定細(xì)胞或它們的形態(tài)（即形狀、體積、長度、面積）都是有意義的參數(shù)。
熒光顯微鏡有助于識別特定標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞成分。因此，要么用轉(zhuǎn)熒光標(biāo)記基因生物，要么用免疫熒光染色。此外，某些基因和轉(zhuǎn)錄也可以通過熒光原位雜交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 進行可視化。
3D組織成像的一個示例是，對腦部神經(jīng)元進行成像，以確定它們的長度、體積或與其它細(xì)胞的連接。例如，可以對患有局部腦缺血的模式生物制作腦部切片，以了解形態(tài)差異和細(xì)胞數(shù)量。
挑戰(zhàn)
首要的挑戰(zhàn)之一是使用顯微鏡初步觀察樣本。需要將樣本置于載物臺上并不斷調(diào)整三維位置以確保對樣本進行正確成像。你從目鏡或屏幕上看到的只是樣本極小的一部分。因此，要將樣本保持在正確的焦距內(nèi)并找到正確位置，以便找到感興趣的區(qū)域，是一個非常麻煩的過程。MICA的樣本查找功能通過將樣本聚焦并生成每個相關(guān)區(qū)域的低倍率預(yù)覽圖來自動化這個過程，這個功能可以用于整個成像過程的定位。
下一個挑戰(zhàn)是設(shè)置成像參數(shù)，因此可以在看到感興趣的信號下，避免樣本遭受不必要的光漂白。這一步驟通常要同時選擇激發(fā)和接受檢測的技術(shù)參數(shù)，因為每一項參數(shù)都會對樣本和獲得的結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。使用MICA，您只需輕輕點擊一下“Live”，便可自動完成可視化熒光所需的所有參數(shù)設(shè)置。可隨時通過點擊“OneTouch”執(zhí)行這一自動化設(shè)置來優(yōu)化當(dāng)前視圖的參數(shù)。更改顯微鏡的特定技術(shù)參數(shù)前，實驗人員通常需要了解更改參數(shù)將產(chǎn)生的影響，但在MICA中，設(shè)置是輸出驅(qū)動型的，也就是說，可定義所需的輸出，然后自動完成對應(yīng)的調(diào)整。
一般而言，第一步是確定要成像的正確位置。實驗人員需要使用目鏡了解樣本的整體概況，并記住不同的位置。數(shù)字顯微鏡可以生成樣本的概覽，這可以提供一些幫助，但實驗人員仍然需要指出圖像中要進一步成像的位置。
MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低倍或高倍的預(yù)覽，輕松定位感興趣的區(qū)域，并可以使用工具直接在圖像上標(biāo)記出感興趣的樣本區(qū)域。這樣后續(xù)高分辨率圖片就可以保存下來。
高放大倍數(shù)物鏡通常需要使用浸沒式介質(zhì)，最常見的是水和油。水為水溶液中的成像樣品匹配了最佳的光學(xué)指數(shù)，而油為包埋的成像樣品匹配了最佳的光學(xué)指數(shù)。水浸物鏡也可用于固定式樣本，但會稍微影響成像質(zhì)量。MICA可同時滿足兩種需求。水鏡還具有全自動化操作的額外優(yōu)勢，水的浸入可以自動建立并維持。為進一步提高光學(xué)質(zhì)量，一些物鏡會通過校正環(huán)來補償樣本板的厚度。校正環(huán)可手動、也可自動操作。MICA配置了自動校正環(huán)功能，可實現(xiàn)自動優(yōu)化。
相對厚度是組織切片成像的另一大挑戰(zhàn)。厚切片會形成較多的散射光，干擾所需信號。THUNDER可減少背景模糊，為組織成像提供了一種寶貴的計算成像方法。 MICA集THUNDER于一體，可在合理的時間范圍內(nèi)確定感興趣的區(qū)域。
除了類似于THUNDER的計算清除方法，共聚焦激光掃描顯微術(shù)(CLSM)等光學(xué)部分也是3D組織玻片成像的一種方法。這種方法中，可獲得性和可用性方面也是挑戰(zhàn)。
除了技術(shù)設(shè)置比較復(fù)雜，共聚焦顯微鏡所需的培訓(xùn)時間一般也更長。MICA集共聚焦和寬場成像于一體，最大程度減少了成像參數(shù)設(shè)置，縮短了所需的培訓(xùn)時間，同時也降低了操作顯微鏡的技能要求。
另外，共聚焦和寬場成像模式的圖像設(shè)置有相同的外觀和使用感受，因此，用戶無需學(xué)習(xí)兩種系統(tǒng)的操作方法。而且，用戶可隨意在寬場和共聚焦兩種模式間切換而無需在兩種成像系統(tǒng)間轉(zhuǎn)移樣本。
科學(xué)實驗的一個關(guān)鍵方面是，改變盡可能少的變量，以確定對樣本和結(jié)果的任何影響。除了保證樣本處理相同外，另一個方面是針對激發(fā)和接收檢測成像參數(shù)相同。MICA默認(rèn)在不同項目中保持成像參數(shù)不變，用戶僅基于自己的需求進行調(diào)整。可根據(jù)參考圖像輕松恢復(fù)成像參數(shù)。
方法
三個厚度為250µm的小鼠腦部切片包含下述熒光標(biāo)記物：
圖1：用于玻片成像的MICA玻片夾，例如組織切片。
在樣本定義中輸入蓋玻片類型和染料等基本信息。利用這一信息，Sample Finder可以識別蓋玻片并自動生成低倍的預(yù)覽。對整個蓋玻片的預(yù)覽可以用來識別三個組織切片，然后用Navigator工具進行標(biāo)記。隨后無需手動調(diào)整成像參數(shù)，便可以在20倍寬場模式下對標(biāo)記區(qū)域生成掃描拼接圖像。在這個放大倍數(shù)和分辨率下，就能在組織切片上識別出感興趣的區(qū)域，然后用共聚焦顯微鏡成像。此時，MICA會在相關(guān)區(qū)域切換為共聚焦模式，記錄高清晰圖像，包括三維立體圖像。定義三維立體圖像時，可以手動或單擊鼠標(biāo)自動設(shè)置限制。z Range Finder工具自動確定3D圖像掃描開始和結(jié)束部分。
成像后，可借助MICA Learn & Results工具測量樹突棘。為此，使用pixel classifier在疊層投影下識別棘突。pixel classifier簡單易用且功能強大，用戶只需使用類似于繪畫工具的繪圖工具標(biāo)記對象的示例，在這種情況下為棘突。通過訓(xùn)練模型，更好地再現(xiàn)輸入，然后提供圖像中其他對象的預(yù)覽。經(jīng)過訓(xùn)練后，就可使用模型分析圖像。
結(jié)果
找到載玻片預(yù)覽上單個腦部切片，然后使用Magic Wand工具進行標(biāo)記以進行掃描拼接。Magic Wand自動識別組織切片的邊界并相應(yīng)地定義所需的拼接。
圖2： MICA在實驗開始時進行完整的玻片預(yù)覽（寬場），便于更輕松地定位。借助該信息的信息，可找到大圖掃描拼接的感興趣區(qū)域�？墒褂肕agic Wand工具自動化檢測感興趣區(qū)域。
MICA可同時采集最多四個熒光團，因此相比基于濾光塊的序列成像的顯微系統(tǒng)，可有效節(jié)約用戶的時間。在單次掃描拼接中，可找到感興趣區(qū)域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍數(shù)觀察更多的細(xì)節(jié)。
二維圖像需要借助三維數(shù)據(jù)以獲得更詳細(xì)的信息。為此，z界面中定義了三維立體模式。
在CLSM下進行立體采集后（120µm厚），可在三維觀察器中可視化數(shù)據(jù)，獲得腦部樣本的更多空間信息。
圖3：三維重構(gòu)CLSM。通過三維采集進一步研究組織切片。
利用獲得的三維信息，用戶可以更好地了解樣本的空間狀況，例如了解細(xì)胞間的連接。
對于定量來說，可根據(jù)三維采集信息生成最大投影來測量樣本樹突棘的平均面積。pixel classifier識別棘突，分析工具則確定面積。得到的數(shù)值可繪制成圖，以可視化數(shù)據(jù)和相關(guān)性。圖4顯示了樹突棘面積的直方圖。這些結(jié)果也可通過箱線圖的形式顯示，來比較不同的樹突棘群落（圖4）。
圖4：分析。
MICA不僅采集圖像，還可對它們進行分析。為此，可使用基于人工智能技術(shù)的pixel classifier來識別相關(guān)的圖像細(xì)節(jié)。隨后，識別出的對象可以被量化并顯示在圖形中。在本示例中，樹突棘的平均面積在最大投影上測量。
結(jié)論
MICA是用于三維組織成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用戶可以快速了解樣本的整體質(zhì)量，確定進一步的操作。隨后，Navigator視圖可對組織切片進行更深入的觀察。Magic Wand等工具用于快速定義感興趣的區(qū)域，加上4個通道的同時成像，可加快大圖掃描拼接的速度。使用新的z界面使三維采集更加簡化，pixel classifier能輔助后續(xù)分析。
簡而言之，MICA集寬場成像和共聚焦成像于一個系統(tǒng)中。它可以幫助用戶在一個系統(tǒng)中完成從圖像預(yù)覽到三維細(xì)節(jié)成像再到分析的整個工作流程。
了解更多：徠卡顯微
3D組織成像廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域。研究人員利用它來揭示組織組成和完整性的詳細(xì)信息，或從實驗操作中得出結(jié)論，或比較健康與不健康的樣本。本文介紹了MICA如何幫助研究人員進行3D組織成像。
3D組織成像
模式生物或患者的組織切片可用于分析從組織到細(xì)胞的各種形態(tài)，進而發(fā)現(xiàn)健康和非健康樣本以及對照樣品和實驗樣品之間的差異。例如，是否存在特定細(xì)胞或它們的形態(tài)（即形狀、體積、長度、面積）都是有意義的參數(shù)。
熒光顯微鏡有助于識別特定標(biāo)記的細(xì)胞或細(xì)胞成分。因此，要么用轉(zhuǎn)熒光標(biāo)記基因生物，要么用免疫熒光染色。此外，某些基因和轉(zhuǎn)錄也可以通過熒光原位雜交 (Fluorescence in Situ Hybridization, FISH) 進行可視化。
3D組織成像的一個示例是，對腦部神經(jīng)元進行成像，以確定它們的長度、體積或與其它細(xì)胞的連接。例如，可以對患有局部腦缺血的模式生物制作腦部切片，以了解形態(tài)差異和細(xì)胞數(shù)量。
挑戰(zhàn)
首要的挑戰(zhàn)之一是使用顯微鏡初步觀察樣本。需要將樣本置于載物臺上并不斷調(diào)整三維位置以確保對樣本進行正確成像。你從目鏡或屏幕上看到的只是樣本極小的一部分。因此，要將樣本保持在正確的焦距內(nèi)并找到正確位置，以便找到感興趣的區(qū)域，是一個非常麻煩的過程。MICA的樣本查找功能通過將樣本聚焦并生成每個相關(guān)區(qū)域的低倍率預(yù)覽圖來自動化這個過程，這個功能可以用于整個成像過程的定位。
下一個挑戰(zhàn)是設(shè)置成像參數(shù)，因此可以在看到感興趣的信號下，避免樣本遭受不必要的光漂白。這一步驟通常要同時選擇激發(fā)和接受檢測的技術(shù)參數(shù)，因為每一項參數(shù)都會對樣本和獲得的結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。使用MICA，您只需輕輕點擊一下“Live”，便可自動完成可視化熒光所需的所有參數(shù)設(shè)置。可隨時通過點擊“OneTouch”執(zhí)行這一自動化設(shè)置來優(yōu)化當(dāng)前視圖的參數(shù)。更改顯微鏡的特定技術(shù)參數(shù)前，實驗人員通常需要了解更改參數(shù)將產(chǎn)生的影響，但在MICA中，設(shè)置是輸出驅(qū)動型的，也就是說，可定義所需的輸出，然后自動完成對應(yīng)的調(diào)整。
一般而言，第一步是確定要成像的正確位置。實驗人員需要使用目鏡了解樣本的整體概況，并記住不同的位置。數(shù)字顯微鏡可以生成樣本的概覽，這可以提供一些幫助，但實驗人員仍然需要指出圖像中要進一步成像的位置。
MICA的Navigator工具可簡化這一過程。用戶可以生成低倍或高倍的預(yù)覽，輕松定位感興趣的區(qū)域，并可以使用工具直接在圖像上標(biāo)記出感興趣的樣本區(qū)域。這樣后續(xù)高分辨率圖片就可以保存下來。
高放大倍數(shù)物鏡通常需要使用浸沒式介質(zhì)，最常見的是水和油。水為水溶液中的成像樣品匹配了最佳的光學(xué)指數(shù)，而油為包埋的成像樣品匹配了最佳的光學(xué)指數(shù)。水浸物鏡也可用于固定式樣本，但會稍微影響成像質(zhì)量。MICA可同時滿足兩種需求。水鏡還具有全自動化操作的額外優(yōu)勢，水的浸入可以自動建立并維持。為進一步提高光學(xué)質(zhì)量，一些物鏡會通過校正環(huán)來補償樣本板的厚度。校正環(huán)可手動、也可自動操作。MICA配置了自動校正環(huán)功能，可實現(xiàn)自動優(yōu)化。
相對厚度是組織切片成像的另一大挑戰(zhàn)。厚切片會形成較多的散射光，干擾所需信號。THUNDER可減少背景模糊，為組織成像提供了一種寶貴的計算成像方法。 MICA集THUNDER于一體，可在合理的時間范圍內(nèi)確定感興趣的區(qū)域。
除了類似于THUNDER的計算清除方法，共聚焦激光掃描顯微術(shù)(CLSM)等光學(xué)部分也是3D組織玻片成像的一種方法。這種方法中，可獲得性和可用性方面也是挑戰(zhàn)。
除了技術(shù)設(shè)置比較復(fù)雜，共聚焦顯微鏡所需的培訓(xùn)時間一般也更長。MICA集共聚焦和寬場成像于一體，最大程度減少了成像參數(shù)設(shè)置，縮短了所需的培訓(xùn)時間，同時也降低了操作顯微鏡的技能要求。
另外，共聚焦和寬場成像模式的圖像設(shè)置有相同的外觀和使用感受，因此，用戶無需學(xué)習(xí)兩種系統(tǒng)的操作方法。而且，用戶可隨意在寬場和共聚焦兩種模式間切換而無需在兩種成像系統(tǒng)間轉(zhuǎn)移樣本。
科學(xué)實驗的一個關(guān)鍵方面是，改變盡可能少的變量，以確定對樣本和結(jié)果的任何影響。除了保證樣本處理相同外，另一個方面是針對激發(fā)和接收檢測成像參數(shù)相同。MICA默認(rèn)在不同項目中保持成像參數(shù)不變，用戶僅基于自己的需求進行調(diào)整。可根據(jù)參考圖像輕松恢復(fù)成像參數(shù)。
方法
三個厚度為250µm的小鼠腦部切片包含下述熒光標(biāo)記物：
- 細(xì)胞核（DAPI，品紅色）
- 神經(jīng)元（細(xì)胞質(zhì)GFP，青色）
- 星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP-DsRed，紅色）
圖1：用于玻片成像的MICA玻片夾，例如組織切片。
在樣本定義中輸入蓋玻片類型和染料等基本信息。利用這一信息，Sample Finder可以識別蓋玻片并自動生成低倍的預(yù)覽。對整個蓋玻片的預(yù)覽可以用來識別三個組織切片，然后用Navigator工具進行標(biāo)記。隨后無需手動調(diào)整成像參數(shù)，便可以在20倍寬場模式下對標(biāo)記區(qū)域生成掃描拼接圖像。在這個放大倍數(shù)和分辨率下，就能在組織切片上識別出感興趣的區(qū)域，然后用共聚焦顯微鏡成像。此時，MICA會在相關(guān)區(qū)域切換為共聚焦模式，記錄高清晰圖像，包括三維立體圖像。定義三維立體圖像時，可以手動或單擊鼠標(biāo)自動設(shè)置限制。z Range Finder工具自動確定3D圖像掃描開始和結(jié)束部分。
成像后，可借助MICA Learn & Results工具測量樹突棘。為此，使用pixel classifier在疊層投影下識別棘突。pixel classifier簡單易用且功能強大，用戶只需使用類似于繪畫工具的繪圖工具標(biāo)記對象的示例，在這種情況下為棘突。通過訓(xùn)練模型，更好地再現(xiàn)輸入，然后提供圖像中其他對象的預(yù)覽。經(jīng)過訓(xùn)練后，就可使用模型分析圖像。
結(jié)果
找到載玻片預(yù)覽上單個腦部切片，然后使用Magic Wand工具進行標(biāo)記以進行掃描拼接。Magic Wand自動識別組織切片的邊界并相應(yīng)地定義所需的拼接。
圖2： MICA在實驗開始時進行完整的玻片預(yù)覽（寬場），便于更輕松地定位。借助該信息的信息，可找到大圖掃描拼接的感興趣區(qū)域�？墒褂肕agic Wand工具自動化檢測感興趣區(qū)域。
MICA可同時采集最多四個熒光團，因此相比基于濾光塊的序列成像的顯微系統(tǒng)，可有效節(jié)約用戶的時間。在單次掃描拼接中，可找到感興趣區(qū)域，并在共聚焦模式下以更高的放大倍數(shù)觀察更多的細(xì)節(jié)。
二維圖像需要借助三維數(shù)據(jù)以獲得更詳細(xì)的信息。為此，z界面中定義了三維立體模式。
在CLSM下進行立體采集后（120µm厚），可在三維觀察器中可視化數(shù)據(jù)，獲得腦部樣本的更多空間信息。
圖3：三維重構(gòu)CLSM。通過三維采集進一步研究組織切片。
利用獲得的三維信息，用戶可以更好地了解樣本的空間狀況，例如了解細(xì)胞間的連接。
對于定量來說，可根據(jù)三維采集信息生成最大投影來測量樣本樹突棘的平均面積。pixel classifier識別棘突，分析工具則確定面積。得到的數(shù)值可繪制成圖，以可視化數(shù)據(jù)和相關(guān)性。圖4顯示了樹突棘面積的直方圖。這些結(jié)果也可通過箱線圖的形式顯示，來比較不同的樹突棘群落（圖4）。
圖4：分析。
MICA不僅采集圖像，還可對它們進行分析。為此，可使用基于人工智能技術(shù)的pixel classifier來識別相關(guān)的圖像細(xì)節(jié)。隨后，識別出的對象可以被量化并顯示在圖形中。在本示例中，樹突棘的平均面積在最大投影上測量。
結(jié)論
MICA是用于三維組織成像的有效工具：使用pixel classifier功能，用戶可以快速了解樣本的整體質(zhì)量，確定進一步的操作。隨后，Navigator視圖可對組織切片進行更深入的觀察。Magic Wand等工具用于快速定義感興趣的區(qū)域，加上4個通道的同時成像，可加快大圖掃描拼接的速度。使用新的z界面使三維采集更加簡化，pixel classifier能輔助后續(xù)分析。
簡而言之，MICA集寬場成像和共聚焦成像于一個系統(tǒng)中。它可以幫助用戶在一個系統(tǒng)中完成從圖像預(yù)覽到三維細(xì)節(jié)成像再到分析的整個工作流程。
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