應(yīng)用熒光成像技術(shù)探究腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤靶向機(jī)制

在針對腫瘤的靶向研究方面，花青熒光團(tuán)所具有的結(jié)構(gòu)固有腫瘤靶向（SITT）特性，由于不再需要與靶向配體進(jìn)行結(jié)合，已越來越受到科學(xué)界的關(guān)注。然而，SITT背后的靶向機(jī)制尚未得到很好的解釋。
另一方面，腫瘤組織中含有大量的免疫細(xì)胞，包括骨髓來源和/或組織駐留的腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞（TRICs/TAICs），這些TAICs可以成為癌癥檢測的主要靶標(biāo)，但目前尚缺乏對于靶標(biāo)免疫細(xì)胞的小分子熒光基團(tuán)的研究報道。
在此，我們很高興可以分享一項來自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院與麻省總醫(yī)院Homan Kang博士團(tuán)隊的最新研究成果，受前期在器官及疾病特異性熒光團(tuán)開發(fā)方面的成功經(jīng)驗啟發(fā)（參見：前沿分享 | 哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院：一種用于靶向治療GIST腫瘤的非粘性、腎臟可清除納米平臺），該團(tuán)隊設(shè)計并合成了一種靶向TAICs的花青熒光團(tuán)SH1，并利用SH1證實了與SITT相關(guān)的腫瘤靶向機(jī)制。
在實際應(yīng)用方面，SH1具有近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-1700 nm）成像能力，能夠在活體組織（如骨髓、腦血管和腫瘤血管）內(nèi)進(jìn)行深層組織成像，顯著降低組織的自發(fā)熒光和散射，具有很高的臨床適用性；此外，因TAIC介導(dǎo)的腫瘤靶向性，SH1無需與額外的靶向配體偶聯(lián)即可具有廣泛的腫瘤靶向性，展現(xiàn)出高腫瘤-背景比（TBR）。作為一種充滿潛力的癌癥靶向劑，SH1在術(shù)中光學(xué)成像和圖像引導(dǎo)的癌癥手術(shù)中將具有巨大的應(yīng)用前景。

部分實驗設(shè)計與結(jié)果分享如下：

• SITT腫瘤靶向機(jī)制探究

將靶向TAICs的熒光團(tuán)SH1靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察到癌變區(qū)域的信號并未在早期時間點出現(xiàn)，而是在數(shù)小時后突然出現(xiàn)（圖1）。與此同時，熒光團(tuán)在骨髓中的免疫細(xì)胞中積累，并隨免疫細(xì)胞浸潤到癌變區(qū)域，導(dǎo)致熒光信號強(qiáng)度隨時間的推移而增強(qiáng)，信號-背景比（SBR）也顯著增強(qiáng)（圖1A，C）。此外，利用NIR-II成像的深層組織穿透能力，可在注射后24 h清楚地觀察活體小鼠的脊柱、胸骨和后肢中的骨髓（圖1C）。據(jù)此，推斷SH1具有兩種不同的腫瘤靶向機(jī)制（圖1D）：①通過體循環(huán)直接到達(dá)癌變區(qū)域，并且在長達(dá)24 h的時間內(nèi)被腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞吸收；②被骨髓中的免疫細(xì)胞內(nèi)化后，隨免疫細(xì)胞浸潤到癌變區(qū)域。

圖1 NIR-II熒光成像和SITT腫瘤靶向機(jī)制

（將50 nmol的SH1靜脈注射到胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）小鼠模型中。紅色圓圈和虛線表示感興趣區(qū)域。激發(fā)光：808 nm，濾光片：1070 nm LP，曝光時間：50 ms。）

A）B）腫瘤組織和脊柱骨髓中信號隨時間的變化

C）SH1在脊柱、胸骨和后肢骨髓中的攝取情況

D）SH1熒光團(tuán)靶向腫瘤的兩步機(jī)制示意圖：

①直接靶向腫瘤細(xì)和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞；

②被靶向后的腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞通過血管遷移，浸潤到癌變區(qū)域。

• 基于花青的SH1熒光團(tuán)設(shè)計

對各種花青熒光團(tuán)進(jìn)行體內(nèi)篩選后，研究人員設(shè)計并合成了SH1（圖2A），其光學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)，如吸光度和熒光光譜、電荷分布和極化率等如圖2B-D所示。SH1具有較長的NIR-I區(qū)發(fā)射波長（最大值820 nm）和NIR-II區(qū)發(fā)射尾（尾發(fā)射高達(dá)~1250 nm，這是其具有NIR-II成像能力的關(guān)鍵）。在5% BSA鹽溶液中，與市售的NIR-II染料IR-E1050和IR26相比，SH1具有更高的量子產(chǎn)率（SH1：11%，IR-E1050：0.2-2%，IR26：0.05-0.5%）。同時，與吲哚菁綠（ICG，F(xiàn)DA唯一批準(zhǔn)的可用于體內(nèi)NIR-II成像的熒光染料）相比，SH1在NIR-II區(qū)具有更高的熒光亮度（225%）。

圖2 SH1熒光團(tuán)設(shè)計圖示及光學(xué)、理化性質(zhì)

• 評估SH1靶向的細(xì)胞類型

利用流式細(xì)胞術(shù)，評估骨髓和腫瘤TAICs中SH1的靶細(xì)胞類型。結(jié)果表明，SH1靶向的大多是骨髓中的免疫相關(guān)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（圖3）。此外，通過免疫組織化學(xué)染色和組織學(xué)熒光分析，可以觀察到由于靶向免疫細(xì)胞的浸潤，導(dǎo)致腫瘤組織中的熒光信號顯著增加（圖3C）。

圖3 骨髓和腫瘤組織中SH1靶向的免疫細(xì)胞

將SH1、ICG和IR-780注射到LLC荷瘤小鼠體內(nèi)，SH1可在注射后48 h時在腫瘤區(qū)域顯示出極好的信號強(qiáng)度，而ICG由于快速被肝膽清除而沒有顯示出良好的腫瘤靶向性（圖4A，C）。IR-780顯示出與SH1不同的腫瘤積累模式，在注射后4h左右的早期時間點在腫瘤中積累。

另一方面，研究人員創(chuàng)新地引入了三維（3D）熒光斷層掃描（FLECT/CT）成像技術(shù)，對注射后24 h和48 h時每種染料在癌癥區(qū)域的百分比劑量（%ID）進(jìn)行定量評估（圖4G；圖5）。結(jié)果顯示，從注射后24 h到48 h，SH1的%ID增加了2倍以上，這一結(jié)果有力地支持了研究人員此前的推斷，即隨著時間的推移，SH1靶向的TAICs遷移會增強(qiáng)腫瘤-背景比（TBR）。


圖4 對LLC荷瘤小鼠進(jìn)行SH1腫瘤靶向的體內(nèi)成像，并與IR-780和ICG作比較
A）各染料注射后48 h內(nèi)進(jìn)行NIR-II熒光成像；
C）48h內(nèi)腫瘤部位的信號強(qiáng)度變化；
G）使用兼具x-ray CT功能的3D熒光斷層掃描（FLECT/CT）成像技術(shù)，對各染料在注射后24h和48 h的腫瘤積累進(jìn)行相對定量分析。
綠色區(qū)域表示用于定量分析的感興趣體積（VOI），與傳統(tǒng)二維成像中的感興趣區(qū)域（ROI）相比，對目標(biāo)部位進(jìn)行三維體積層面的數(shù)據(jù)采集，可以使分析內(nèi)容更加接近體內(nèi)真實情況，獲得更加準(zhǔn)確的定量分析結(jié)果，而二維光學(xué)成像往往無法滿足精確定位與定量分析的需求。

圖5 利用3D熒光斷層掃描（FLECT/CT）成像技術(shù)對腫瘤部位的信號積累進(jìn)行相對定量分析

A）B）LLC荷瘤小鼠在注射標(biāo)準(zhǔn)樣品后24 h和48 h的3D熒光斷層圖像
（FLECT/CT：一種將三維熒光斷層掃描與x-ray CT相結(jié)合的多模態(tài)成像系統(tǒng)。FLECT掃描：以每層116個投影、780 nm激光激發(fā)和853/45 nm帶通熒光發(fā)射濾光片進(jìn)行。CT掃描：采用每層360個投影、35 kV管電壓、950 μA管電流和100 ms曝光進(jìn)行。使用VivoQuant圖像分析軟件對3D熒光圖像進(jìn)行定量分析，且FLECT圖像和CT圖像可以在VivoQuant軟件中互相配準(zhǔn)，實現(xiàn)對目標(biāo)信號的準(zhǔn)確定位。）
C）D）對填充有不同濃度梯度（2.5、5、10 μM）的熒光染料標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行連續(xù)掃描，并執(zhí)行上述VOI分析，制作濃度和信號強(qiáng)度曲線，線性回歸方程擬合優(yōu)度（R2）＞0.999，證明FLECT/CT的線性響應(yīng)性能完全符合要求，定量分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
E）定量結(jié)果匯總數(shù)據(jù)。
技術(shù)亮點：
通過本項研究，Homan Kang博士團(tuán)隊首次闡明了TAIC介導(dǎo)的腫瘤靶向機(jī)制，并利用流式細(xì)胞術(shù)、組織學(xué)、體內(nèi)NIR-II熒光成像以及新型的3D熒光斷層成像（FLECT/CT）技術(shù)進(jìn)行證實。SH1的NIR-II功能允許操作人員觀察活體深層組織中的信號，而FLECT/CT技術(shù)則可以在獲取三維NIR熒光圖像的同時，實現(xiàn)準(zhǔn)確的定位與定量分析功能。實驗過程中，相關(guān)的三維成像操作與數(shù)據(jù)定量分析工作，均由InSyTe™ FLECT/CT系統(tǒng)研發(fā)團(tuán)隊的Austin Moy博士（TriFoil Imaging）協(xié)助完成，因FLECT/CT成像技術(shù)作為下一代分子成像技術(shù)、在三維熒光斷層掃描與定量分析方面所具有的創(chuàng)新性和先進(jìn)性，Moy博士也成為本項研究的合著作者之一。

原文標(biāo)題：Tumor-Associated Immune-Cell-Mediated Tumor-Targeting Mechanism with NIR-II Fluorescence Imaging

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