磷脂納米盤Nanodisc的產(chǎn)品應(yīng)用

                                          圖1：穩(wěn)定膜蛋白的納米盤示意圖
                                          綠色：穩(wěn)定帶 - 在本例中為MSP 蛋白
                                          灰色：磷脂
                                          橙色：穩(wěn)定的膜蛋白

納米盤一詞描述了一種小尺寸（直徑：7-50 nm）圓盤狀結(jié)構(gòu)物，可應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。納米盤主要由兩個(gè)組件構(gòu)成：1、磷脂，可以是人造磷脂或細(xì)胞膜磷脂2、將磷脂綁定在一起的穩(wěn)定帶，可以是 MSP 蛋白或合成聚合物。

Nanodisc納米盤的用途
問題是，與可溶性蛋白質(zhì)不同，膜蛋白嵌在脂質(zhì)膜中，因此很難在天然環(huán)境中對(duì)其進(jìn)行分析。磷脂雙分子層疏水核心中的膜蛋白表層也具有疏水性，而與水性膜環(huán)境接觸的表層區(qū)與普通可溶性蛋白的表層一樣具有親水性（2）。同一分子上廣泛存在疏水和親水表面，這是膜蛋白的特征。因此，在缺乏增溶劑的情況下，膜蛋白不溶于標(biāo)準(zhǔn)緩沖水溶液。例如，納米盤需要溶解膜蛋白，以模擬磷脂雙分子層的兩親環(huán)境，同時(shí)將膜蛋白的結(jié)構(gòu)維持在生理相似的狀態(tài)。

兩種納米盤類型
納米盤用于模擬細(xì)胞的天然磷脂雙分子層，以此來尋找靶分子（通常為膜蛋白）。膜蛋白是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵物質(zhì)，介導(dǎo)基本的生物過程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程、化學(xué)信號(hào)傳感及胞間相互作用的協(xié)調(diào)。

多種人體疾病都與膜蛋白有關(guān)，膜蛋白因而成為藥物開發(fā)的重要靶標(biāo)。然而，出乎意料的是，膜蛋白由高達(dá)約23%的基因進(jìn)行編碼，而其占已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的比率卻不足1%（1）。
   
但首先，我們將分別介紹這兩種納米盤，先從 MSP 納米盤開始。
 
MSP納米盤

MSP 納米盤通過膜支架蛋白（MSP）固定在一起。MSP可以是截短型載脂蛋白（apo）A-I，其包裹在一小塊磷脂雙分子層上，形成圓盤狀顆�；蚣{米盤（5）。MSP提供了面向脂質(zhì)疏水尾的疏水面，以及外部的親水面。這樣設(shè)置使得納米盤在水溶液中高度可溶。一旦組裝成納米盤，就可以在沒有去污劑的情況下將膜蛋白保持在溶液中（5）。 尺寸：MSP 納米盤的尺寸范圍為 7 - 17 nm。尺寸由所采用的膜支架蛋白決定。表 2 描述了 由Cube Biotech 提供的膜支架蛋白及相關(guān)的納米盤尺寸。相同 MSP 蛋白的MSP 納米盤尺寸均一，直徑僅相差 +/- 1 nm。非常適合進(jìn)行使用冷凍電鏡（Cryo-EM）的研究。
 
MSP納米盤的其他優(yōu)點(diǎn)

與其他膜蛋白增溶和重組系統(tǒng)相比，MSP納米盤具備許多優(yōu)勢，尤其在配體結(jié)合研究、構(gòu)象動(dòng)力學(xué)分析以及蛋白質(zhì)相互作用研究等方面（6）。納米盤可用于在類似于天然膜的人工環(huán)境中重組GPCR 或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等膜蛋白質(zhì)。 這些經(jīng)由納米盤穩(wěn)定的蛋白質(zhì)可通過常規(guī)的色譜層析程序直接純化。得到的純化膜蛋白-納米盤復(fù)合物可應(yīng)用于需要接觸蛋白質(zhì)的生理細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外表面的場景，從而能夠不受限制地接觸拮抗劑、激動(dòng)劑、G 蛋白及其他相互作用對(duì)象（7）。
 
如何生成 MSP納米盤 + 蛋白質(zhì) - 復(fù)合物
A：結(jié)合納米盤與無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)從表達(dá)質(zhì)粒開始，可在無細(xì)胞系統(tǒng)中生成膜蛋白。在整合了初生膜蛋白（8）的混合物中提供預(yù)組裝納米盤。不需要額外添加去污劑，這樣可以最大限度地減少偽影的存在。作為一個(gè)可選項(xiàng)，可以將生物素酰化或同位素標(biāo)記等修飾包含在內(nèi)。

B：去污劑增溶蛋白質(zhì)的兩步重組從合適去污劑中的純化膜蛋白開始，添加膜支架蛋白和磷脂。包含膜蛋白的納米盤可自發(fā)形成，并通過親和或排阻層析法純化得到（6，7）。

C：直接從膜增溶從表達(dá)目標(biāo)蛋白的膜開始，添加去污劑和膜支架蛋白（MSP）。膜磷脂、膜蛋白和 MSP 組裝形成納米圓盤復(fù)合物（5）。此處，獲得了表征膜蛋白群的納米盤復(fù)合物的混合物，可用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。如果需要，可采用親和色譜法純化對(duì)單個(gè)膜蛋白-納米盤復(fù)合物進(jìn)行純化處理。與方法 B 相比，接觸去污劑的時(shí)間明顯縮短了（從按天數(shù)縮短為按小時(shí)）。
 
磷脂的選擇——維持適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)活性的關(guān)鍵

如前所述，MSP 納米盤的磷脂成分是人造的。這意味著，必須事先確定好構(gòu)成目的膜蛋白所需人工膜環(huán)境的磷脂。但存在多種磷脂可供選擇，應(yīng)該選擇哪一種呢？

對(duì)于這個(gè)問題，請(qǐng)參閱我們最常用于 MSP 納米盤的磷脂列表：    
這些選項(xiàng)以及其他眾多磷脂已成功實(shí)現(xiàn)單獨(dú)或組合應(yīng)用（8，25）。脂質(zhì)的選擇已經(jīng)被證明對(duì)蛋白質(zhì)活性是至關(guān)重要的（8），例如在脂質(zhì)促進(jìn)蛋白質(zhì)低聚反應(yīng)的情況下（25）。使用組裝好的納米盤進(jìn)行無細(xì)胞表達(dá)是圍繞各種脂質(zhì)和脂質(zhì)混合物對(duì)蛋白質(zhì)的影響對(duì)其進(jìn)行篩選的快捷簡便方法。
 
納米盤在科學(xué)中的應(yīng)用實(shí)例

MSP納米盤最初是由Sligar及其同事一起發(fā)表的（3，4）。MSP納米盤為穩(wěn)定膜蛋白提供了完美的環(huán)境，使得通過NMR 和 SPR（9，10）等方法研究配體、激動(dòng)劑或拮抗劑的結(jié)合成為可能。納米盤被證實(shí)可以提高 在冷凍電鏡中跨膜蛋白區(qū)的分辨率（22，26）。膜支架蛋白可采用組氨酸標(biāo)記，以促進(jìn)蛋白質(zhì)納米盤復(fù)合物的純化、檢測和固相處理。其他納米盤應(yīng)用的實(shí)例包括共振拉曼（11）、MALDI（13）、非共價(jià)質(zhì)譜法（25）、蛋白激活研究（14）、時(shí)間分辨熒光光譜（15）和蛋白質(zhì)結(jié)晶（24）。重組成納米盤的抗原已被用于提高小鼠的免疫原應(yīng)答，顯示出其作為疫苗的潛力 （16）。此外，“大腸桿菌”的整個(gè)膜蛋白質(zhì)組被重組為納米盤，從而創(chuàng)建出水溶性膜蛋白庫 （15）。在納米盤中重組的蛋白質(zhì)可以轉(zhuǎn)移到雙層膜微胞中以提高 NMR 分辨率（23）。在納米盤的協(xié)助下，甚至實(shí)現(xiàn)了對(duì)可溶性蛋白質(zhì)以及與脂質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)的分析 （20）。表 3 列出了納米盤應(yīng)用的實(shí)例。
   
參考文獻(xiàn)

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