使用超多標(biāo)組織成像表征胰腺導(dǎo)管腺癌中的腫瘤微環(huán)境

胰腺四周布滿了十二指腸和膽總管等高度血管化的器官。胰腺癌經(jīng)常侵襲并轉(zhuǎn)移至周圍的器官以及更遠(yuǎn)位置的器官，例如肝臟、腹膜、肺、大腦、腎臟和骨骼。傳統(tǒng)的化療加放療或疾病晚期的化療加靶向藥物治療可以延長患者的生存期。但是，即使腫瘤局限的患者中，也僅有40%左右的患者能夠達(dá)到5年的生存期。這就說明亟需為所有胰腺癌患者改善傳統(tǒng)和免疫療法。腫瘤細(xì)胞可以逃避治療并繼續(xù)生長。另外，腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞也是促使持續(xù)性腫瘤生長的關(guān)鍵支持土壤。了解腫瘤微環(huán)境中的所有細(xì)胞的免疫狀態(tài)對于理解腫瘤轉(zhuǎn)移和改進(jìn)癌癥治療方法至關(guān)重要，尤其是免疫療法。

在本研究中，使用了數(shù)十個生物標(biāo)志物研究胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）組織中的腫瘤異質(zhì)性。使用Cell DIVE^™超多標(biāo)組織成像整體分析解決方案，數(shù)十個生物標(biāo)志物可表征腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞異質(zhì)性、細(xì)胞活性和細(xì)胞間的空間位置關(guān)系。我們檢查了腫瘤、基質(zhì)各成分和免疫細(xì)胞對腫瘤微環(huán)境的影響。所使用的生物標(biāo)志物組合可用于檢測腫瘤相關(guān)的基質(zhì)成分和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、炎癥、缺氧、代謝和免疫反應(yīng)。我們發(fā)現(xiàn)這些異質(zhì)性作用經(jīng)常都是相互影響的。例如，腫瘤內(nèi)一些分區(qū)會適應(yīng)缺氧條件并因此導(dǎo)致區(qū)域內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞增殖失控。另外，這些缺氧區(qū)域缺乏免疫細(xì)胞。超多標(biāo)組織全玻片成像支持對腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞活動進(jìn)行空間分辨組織分析，包括對細(xì)胞間相互作用和組織免疫狀態(tài)的研究獲得全新的認(rèn)識。

方法和材料
在本研究中，使用商業(yè)來源（Pantomics）獲得的胰腺導(dǎo)管腺癌的FFPE樣本�？贵w經(jīng)過了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)驗證過程（Gerdes等，2013）以確保抗體的結(jié)合性能類似于組織一抗/二抗間接標(biāo)記。本研究中使用了不同供應(yīng)商提供的三十個生物標(biāo)志物，均作為商業(yè)偶聯(lián)抗體或者自行偶聯(lián)。使用Leica Bond（徠卡生物系統(tǒng)）對玻片進(jìn)行循環(huán)染色；在Cell DIVE上使用四通道+DAPI成像玻片，并對圖像進(jìn)行自動化自發(fā)熒光移除、校正和拼接。使用徠卡顯微系統(tǒng)開發(fā)的專利軟件拼接圖像進(jìn)行導(dǎo)入、融合、可視化和分析。該軟件將于2023年上半年上市。

結(jié)果
使用Cell DIVE超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案，用30個生物標(biāo)志物循環(huán)染色了一個PDAC FFPE切片，確定侵襲性腫瘤細(xì)胞的空間狀態(tài)。本研究中使用的標(biāo)志物在空間上確定了腫瘤內(nèi)的代謝和缺氧、凋亡、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫細(xì)胞狀態(tài)（圖1 A）。在使用全套30個生物標(biāo)志物進(jìn)行細(xì)胞分割后，一小部分生物標(biāo)志物被用來對腫瘤的異質(zhì)區(qū)域進(jìn)行分類和空間表征（圖1B）。具體來說，缺氧標(biāo)志物Glut1和兩個PanCK生物標(biāo)志物區(qū)分出了葡萄糖攝取量增加的癌細(xì)胞，這是一個癌癥標(biāo)志。通過這種方式，將腫瘤中侵襲性較強區(qū)域的細(xì)胞類型與侵襲性較弱區(qū)域或正常組織的細(xì)胞分開分析，可以減少異質(zhì)性。量化各區(qū)域的免疫貢獻(xiàn)，常氧腫瘤和正常胰腺與缺氧腫瘤區(qū)域相比，缺氧區(qū)域的淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞總體減少，盡管所有區(qū)域的細(xì)胞總數(shù)接近（圖1D）并顯示了代表性的表型圖像（圖1D底部）。

通過聚類分析無偏差性的確定了細(xì)胞亞群。聚類分析和降維顯示，與其他區(qū)域相比，缺氧腫瘤區(qū)域的該細(xì)胞群體較少（圖2）。與基于表型的免疫細(xì)胞計數(shù)類似，在缺氧腫瘤區(qū)域存在極少的淋巴細(xì)胞（圖2C聚類和UMAP）。有趣的是，幾個聚類顯示了具有明顯膠原沉積的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）群體（圖2C；橙色方框）。此外，對空間聚類關(guān)系的分析清楚地確定了與CAF（腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞）在同一空間鄰域中常見的細(xì)胞類型（圖2C；鄰域圖）。例如，聚類5（SMA+基質(zhì)集群）和聚類8（免疫細(xì)胞；CD45+，膠原蛋白+）是聚類16（SMA+膠原蛋白+；ClAP1+）的共同鄰居，表明炎癥和腫瘤導(dǎo)致的結(jié)締組織增生通常與PDAC患者的不良生存結(jié)果有關(guān)²。

結(jié)論
我們的研究展示了使用Cell DIVE超多標(biāo)組織成像分析整體解決方案對單個PDAC切片進(jìn)行30種生物標(biāo)志物的循環(huán)染色和成像。在腫瘤微環(huán)境中，結(jié)合使用超多標(biāo)組織成像和單細(xì)胞分析可形成強大的功能，能夠在腫瘤的侵襲性區(qū)域詳細(xì)檢測單細(xì)胞生物標(biāo)志物的表達(dá)。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)、和癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞（CAF）的貢獻(xiàn)得到了空間上的確定。

未來的工作將會進(jìn)一步確定PDAC中的細(xì)胞外基質(zhì)、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）和炎癥成分。例如，除了C0L1A1之外，還可以探索其他膠原蛋白、纖連蛋白和SPARC，以及參與CAF浸潤和炎癥的其他因素。

重要的是，Cell DIVE超多標(biāo)組織成像整體分析解決方案可以保留組織，生物標(biāo)志物的表達(dá)可以繼續(xù)在同一組織切片上進(jìn)行探索，并與研究中所有先前染色的生物標(biāo)志物重疊。表征腫瘤侵襲性區(qū)域的腫瘤微環(huán)境有助于闡明導(dǎo)致患者預(yù)后不佳的新機制，并有助于發(fā)現(xiàn)新的干預(yù)措施以提高未來治療PDAC的成功率。

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參考文獻(xiàn)：