螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶在報告基因實驗中的作用原理及應用

對于自然界中的生物發(fā)光現(xiàn)象，大家應該都是比較熟悉的，其廣泛存在于海洋生物、微生物和陸生生物中。生物發(fā)光現(xiàn)象其實是在生物體內由于生命過程中由化學反應介導的將化學能轉化為光能所產生的，這其中起到主要作用的是一種叫熒光素酶的物質。熒光素酶是自然界中能夠產生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，最具代表性的是螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶，被廣泛應用到生物學的報告基因中——一類可以編碼熒光蛋白或酶，從而將看不見的底物轉化為發(fā)光或彩色產物的一類基因報告系統(tǒng)，光信號可通過發(fā)光檢測儀或CCD相機進行檢測，是生物醫(yī)學領域基礎研究的一個重要工具，廣泛應用于檢測細胞的信號轉導和基因表達。
 

螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶雖然同屬于熒光素酶，但是它們的來源及發(fā)光原理、發(fā)光顏色、檢測波長等都不盡相同。

表1 兩種熒光素酶作用原理的區(qū)別

螢火蟲熒光素酶發(fā)光原理：

海腎熒光素酶發(fā)光原理：

利用熒光素酶與底物結合發(fā)生化學發(fā)光反應的特性，可以把感興趣的基因的轉錄調控元件克隆在熒光素酶基因的上/下游，構建成熒光素酶報告質粒。然后轉染細胞，經適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。
 

圖2 熒光素酶報告基因檢測流程圖
 

由于螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的底物和發(fā)光顏色不同，并且易于定量，檢測靈敏度高，所以在雙報告基因實驗中得到廣泛應用。在雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)中螢火蟲熒光素酶一般是作為主報告基因， 海腎熒光素酶通常作為內參報告基因，來標定檢測用報告基因的測量結果，從而達到有效地減少實驗誤差的目的。