Rhapsody單細胞測序助力解析基底脊索動物合子激活全過程
海洋生物細胞由于其復(fù)雜性，在單細胞測序?qū)嶒炛谐晒β释^低。而BD Rhapsody憑借其特點和優(yōu)勢，讓海洋生物單細胞測序研究不再有后顧之憂：
1.BD Rhapsody最大程度降低外界對實驗的干擾
基于微孔板原理，細胞自然沉降，不會對細胞產(chǎn)生任何壓力刺激，在細胞裂解后，磁珠捕獲mRNA，之后被磁鐵回收，所有外界干擾因素如化學試劑、金屬離子、酶等都會被清洗，在干凈的反應(yīng)體系中進行后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實驗，最大程度降低細胞剪切力、溫度、化學試劑對細胞的刺激和影響，不會改變轉(zhuǎn)錄本表達特征，真實還原實驗設(shè)計預(yù)期條件。
2. BD Rhapsody Scanner質(zhì)控系統(tǒng)，過程監(jiān)控，確保質(zhì)量
尤其是有些海洋生物細胞偏小、mRNA含量偏低，在細胞捕獲過程中，會造成一定的細胞數(shù)目偏差。BD Scanner可視化質(zhì)控系統(tǒng)，能實時監(jiān)控單細胞實驗情況并輸出包含細胞濃度、細胞計數(shù)、細胞活性、雙細胞率、細胞回收率、磁珠回收率等數(shù)據(jù)報告，從而可以及時調(diào)整實驗參數(shù)，有效保證實驗質(zhì)量。
那么如何利用BD Rhapsody進行海洋生物單細胞實驗?zāi)�？下面就�?ldquo;小海膽”一起看一篇文獻實例吧~
研究背景
合子基因組激活是胚胎早期發(fā)育過程中一個普遍的過程，涉及到合子細胞核的重編程，并啟動整體轉(zhuǎn)錄。近些年來，研究者使用不同的生物模型來探究這個過程，并且提出了不同的合子基因組激活機制的模型，包括核質(zhì)比模型，激活因子積累模型，染色質(zhì)動態(tài)變化模型。然而合子基因組激活卻仍未有一個共性的認知，尤其是對管家基因再激活過程。海鞘作為脊椎動物的近親之一，已被用于胚胎研究多年，多種不同海鞘的細胞譜系已得到表征，并且也有基因組測序數(shù)據(jù)。
2022年6月1日，中國海洋大學董波研究團隊和昆明理工大學陳凱團隊，在bioRxiv上發(fā)表了題為“Spatiotemporal dynamics of zygotic genome activation in basal chordates revealed by interspecific hybrids”的研究論文。該研究論文利用兩種不同的海鞘物種進行雜交，通過同源基因的多樣性區(qū)分不同來源的基因，發(fā)現(xiàn)了在8細胞到110細胞階段會有兩波分別代表早期胚胎發(fā)育和管家基因再激活的合子基因組激活過程。比較分析揭示了母本與合子基因間的調(diào)控以及等位特異性表達的調(diào)控是以物種的方式而不是親本相關(guān)的方式。作者利用BD Rhapsody單細胞平臺解析了早期神經(jīng)元階段海鞘胚胎單細胞轉(zhuǎn)錄組譜式，揭示了父源管家基因的時空差異性激活與每種細胞類型的力學性質(zhì)顯著相關(guān)。這為人們了解基底脊索動物的進化和適應(yīng)提供了新的研究系統(tǒng)。
實驗結(jié)果：
兩種不同海鞘物種的雜交及轉(zhuǎn)錄組測序
Ciona robusta 和 C. savignyi 是兩種形態(tài)相似但已經(jīng)分開進化122百萬年的被囊動物。這兩種海鞘高度分化且具有互育性，因此可以作為研究雜交胚胎的優(yōu)秀模型。作者首先評估了雜交胚胎的發(fā)育能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在尾芽期胚胎之前，不同雜交的胚胎發(fā)育時相和形態(tài)是類似的。盡管這兩種海鞘形態(tài)相似，但在基因組上有很大差異，因此可以用于區(qū)分等位基因的親本來源。為了解析合子轉(zhuǎn)錄本的激活，作者收集了1,2,4,8,16,32,64,100細胞時期胚胎和中期囊胚，早期神經(jīng)元進行bulk RNA測序，64細胞，110細胞和早期神經(jīng)元階段進行單細胞測序。
胚胎早期發(fā)育過程中兩波協(xié)調(diào)的合子激活
作者將 C. robusta 和 C. savignyi 的雜交胚胎的RNA數(shù)據(jù)比對回基因組發(fā)現(xiàn)，不管是Cs ♂ × Cr♀ 或 Cr ♂ × Cs♀的胚胎，在4細胞之前，>99.99%的數(shù)據(jù)都比對到了母本。父本轉(zhuǎn)錄組從8細胞時期開始檢測到，從16到32細胞階段比例開始顯著增加。另一個階段是從64細胞到110細胞階段，父本轉(zhuǎn)錄組比例開始增加。這種父母本基因組不同比例轉(zhuǎn)錄本的情況在神經(jīng)元早期和晚期開始消失。
作者接下來分析了基因表達水平的FPKM值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合子基因的首次表達出現(xiàn)在8細胞階段，在從16到32細胞階段以及從64到110細胞階段開始增加。父源基因的WGCNA分析發(fā)現(xiàn)，Cs♂ × Cr♀子代胚胎的基因可以分為5類，1類基因在16到32細胞階段上調(diào)，2到3類基因在64到100細胞階段上調(diào)。GO分析發(fā)現(xiàn)1類基因主要與調(diào)控相關(guān)，可能在第2波合子激活過程中起到調(diào)節(jié)作用。
Figure1. 海鞘胚胎發(fā)育過程中兩波協(xié)調(diào)的合子激活
雜交模型胚胎發(fā)育過程中等位基因的激活
接下來作者比較了母本中兩波合子激活的調(diào)控關(guān)系。兩個物種中整體調(diào)控的模式可能是相似的。作者首先鑒定了調(diào)控基序注釋好的轉(zhuǎn)錄因子，接下來就開始查看這些轉(zhuǎn)錄因子與對應(yīng)基因之間的調(diào)控關(guān)系。基序分析發(fā)現(xiàn)第一波合子激活中調(diào)控基因多與母本轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，而第二波合子激活中則與合子表達基因相關(guān)。通過比較兩種物種的發(fā)育相關(guān)基因發(fā)現(xiàn)，合子激活中兩個物種間轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控基因的關(guān)系是相似的。
作者進一步分析了等位基因特異性表達的情況，在檢測到的5,879個同源基因中，有341個基因是合子特異性表達的。從8細胞到32細胞階段的早期表達基因主要都是母本主導基因，而在64到110細胞胚胎的過渡階段，開始檢測到更多的父源基因。從110細胞胚胎到晚期神經(jīng)元階段，分別有138和106個基因是Cr和Cs主導的。
Figure2. 雜交模型胚胎發(fā)育過程中等位基因的激活
單細胞測序揭示管家基因的激活
Ciona的不對稱分裂從16細胞階段起始，時間點要比管家基因的再激活要早。同時Ciona胚胎的不變譜系的嵌合發(fā)育為研究合子激活提供了獨特的優(yōu)勢。作者利用BD Rhapsody單細胞平臺檢測了早期神經(jīng)元胚胎階段的單細胞轉(zhuǎn)錄組。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)64細胞，110細胞和早期神經(jīng)元階段細胞分別可以被分成9,12,19個細胞群，而這些細胞群可以進一步被注釋成內(nèi)胚層、脊索、間充質(zhì)、肌肉、神經(jīng)索、神經(jīng)和表皮等。作者比較了每個細胞群的合子激活。在64細胞階段，內(nèi)胚層細胞中有最高比例的父本轉(zhuǎn)錄組激活。在神經(jīng)元早期，神經(jīng)索和間充質(zhì)B細胞的父系轉(zhuǎn)錄本增加，各類細胞群的父系轉(zhuǎn)錄本比例的差異開始縮小。不同譜系中父系管家基因的重新激活存在差異，這表明管家基因的重新激活并不遵循發(fā)育時鐘模型。此外，作者還用這些數(shù)據(jù)檢測了其他合子激活模型的可靠性。發(fā)現(xiàn)細胞分裂時間與合子基因激活時間不相關(guān)，細胞體積也與Ciona合子激活不相關(guān)。
Figure3. 單細胞測序揭示管家基因的激活
總結(jié)與展望
這項研究工作利用兩種高度分化的海鞘進行雜交，通過同源基因的多樣性來區(qū)分不同基因來源。通過對不同時期雜交胚胎的轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，雜交胚胎的合子激活主要有兩個階段，第一波主要從16到32細胞階，而第二波則從64細胞到110細胞階段，父本轉(zhuǎn)錄組比例開始增加，并且兩波合子基因組激活是有協(xié)調(diào)作用的。最終，論文通過雜交胚胎解析了合子基因組激活的過程和調(diào)控機制，并且為研究人員了解基底脊索動物的進化和適應(yīng)提供了新的研究系統(tǒng)。在這項研究中，BD Rhapsody單細胞平臺發(fā)揮了重要作用，揭示了早期神經(jīng)元胚胎階段的單細胞圖譜和早期神經(jīng)元階段細胞的等位特異性表達，為解析胚胎合子激活的過程提供了數(shù)據(jù)。
單細胞多組學平臺
BD Rhapsody™
BD Rhapsody™ 單細胞多組學分析系統(tǒng)能夠?qū)Τ汕先f個單細胞的蛋白與基因進行數(shù)字定量，提供靈活的定制化Panel及標準化應(yīng)用方案，以滿足不同的實驗需求，其獨特的混樣技術(shù)可有效節(jié)約時間與成本。
