單細(xì)胞解析H3-K27M突變驅(qū)動(dòng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞狀態(tài)和空間景觀

【期刊】：Nature genetics
【影響因子】：41.307
2022年12月，美國(guó)麻省理工大學(xué)Ilon Liu和Mariella G. Filbin教授通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序建立不同年齡組H3-K27M突變驅(qū)動(dòng)的彌漫性中線(xiàn)膠質(zhì)瘤(DMG)患者中線(xiàn)位置圖譜，描述了年齡和空間位置如何根據(jù)共同的驅(qū)動(dòng)基因突變塑造膠質(zhì)瘤細(xì)胞的內(nèi)在和外在特征。

01用單細(xì)胞技術(shù)解決了什么問(wèn)題？
作者利用單細(xì)胞多組學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法分析H3-K27M DMG的擴(kuò)展隊(duì)列，確定了年齡和解剖位置如何根據(jù)共同的驅(qū)動(dòng)基因突變塑造膠質(zhì)瘤細(xì)胞的內(nèi)在和外在特征，這些特征共同決定了常見(jiàn)的K27M突變以及膠質(zhì)瘤空間和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化。
02實(shí)驗(yàn)亮點(diǎn)
通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序配合其它研究手段解釋了與年齡相關(guān)的微環(huán)境因素如何差異地塑造腫瘤細(xì)胞狀態(tài)。
03臨床意義
作者提供了跨空間和時(shí)間的H3-K27M DMG細(xì)胞異質(zhì)性的廣泛資源，有助于描繪特定時(shí)空環(huán)境下的細(xì)胞特性和微環(huán)境生態(tài)位之間的多方面相互作用，以設(shè)計(jì)合理的建模研究和治療框架。

研究背景
由組蛋白3賴(lài)氨酸27至蛋氨酸(H3-K27M)突變驅(qū)動(dòng)的彌漫性中線(xiàn)膠質(zhì)瘤(DMG)是最致命的腦腫瘤之一，發(fā)病率在年幼兒童腦干腦橋區(qū)域達(dá)到峰值。有研究表明腦橋中的前體細(xì)胞和早期神經(jīng)發(fā)育窗口作為K27M突變介導(dǎo)的膠質(zhì)瘤發(fā)生的時(shí)空相關(guān)性。從細(xì)胞內(nèi)在上講，K27M突變導(dǎo)致廣泛的表觀遺傳失調(diào)，從而將發(fā)育受限的細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橹铝鲂愿杉?xì)胞狀態(tài)。然而，對(duì)于不同中線(xiàn)位置(如丘腦、腦橋或脊髓)以及不同年齡組和呈現(xiàn)出不同形態(tài)特征的H3-K27M DMG是否具有相似的細(xì)胞組成還不完全清楚。年齡和區(qū)域特異性組織環(huán)境與H3-K27M DMG的不同臨床解剖學(xué)特征之間的相互作用及其對(duì)腫瘤病理學(xué)的貢獻(xiàn)仍未得到探索。因此，本研究利用單細(xì)胞多組學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法來(lái)分析，進(jìn)一步解析了H3-K27M DMG細(xì)胞群的空間組織，并鑒定了有絲分裂的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系生態(tài)位。 研究結(jié)果
1、跨時(shí)空的H3-K27M DMG細(xì)胞圖譜構(gòu)建
作者對(duì)50個(gè)H3-K27M突變患者腫瘤進(jìn)行了多組學(xué)分析，取腦橋、丘腦、下腦干和脊柱進(jìn)行scRNA-seq/snRNA-seq(圖1a,b)。作者通過(guò)CNA分析以及UMAP圖展示了H3-K27M DMG細(xì)胞組成和按年齡和位置分層的細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性(圖1c-d)。
2、不同時(shí)空背景下的H3-K27M DMG細(xì)胞組成
通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分得到OPC-like、AC-like、OC-like、Cycling、MES-like(圖2a)。其中OPC-like細(xì)胞普遍存在于所有腫瘤中，與年齡或位置無(wú)關(guān)，而MES-like則首次在H3-K27M DMG被檢測(cè)到(圖2a-d)。相同位置和年齡組但不同基因型的原發(fā)性膠質(zhì)瘤的比較支持K27M突變的直接細(xì)胞內(nèi)在效應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞偏向膠質(zhì)/OPC-like而非neuron-like。
利用SCENIC發(fā)現(xiàn)了在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中已知的關(guān)鍵基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRN)在H3-K27M DMG腫瘤細(xì)胞對(duì)應(yīng)物中同樣具有活性，突出了正常發(fā)育的神經(jīng)膠質(zhì)和腫瘤細(xì)胞的相似性(圖2e)。通過(guò)比較腫瘤位置和年齡組的細(xì)胞組成發(fā)現(xiàn)，MES-like在成人腫瘤中顯著富集，又通過(guò)RNA原位雜交進(jìn)行驗(yàn)證(圖2f，2h)，并觀察到MES-like特征與年齡的關(guān)聯(lián)(圖2i)，這表明非編碼突變和/或非遺傳決定因素可能是觀察到的年齡特異性的基礎(chǔ)。因此，H3-K27M DMG偏向于獨(dú)立于年齡或中線(xiàn)位置的OPC-like細(xì)胞身份，這表明K27M癌組蛋白突變本身的細(xì)胞內(nèi)在效應(yīng)。
3、OPC-like亞群的位置特異性
通過(guò)對(duì)OPC-like無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)得到3亞群，OPC-like-1表達(dá)經(jīng)典OPC的marker基因，相比之下，OPC-like-2和OPC-like-3細(xì)胞表現(xiàn)出前OPC分化狀態(tài)(圖3a-f)。使用scRNA-seq數(shù)據(jù)集對(duì)OPC-like亞群特異性GRN的分析發(fā)現(xiàn)，SHOX2和OTX2等TF在OPC-like-1細(xì)胞中具有最特異性的活性(圖3g)。OPC-like-2細(xì)胞特有的GRN包括Notch信號(hào)調(diào)節(jié)因子HES6以及HOX家族的多個(gè)圖案化TF，OPC-like-3細(xì)胞的GRN特征與AP-1 TF家族相關(guān)(圖3g)。比較OPC-like亞群在時(shí)空分層的來(lái)源，腦橋中前OPC-like細(xì)胞顯著富集，OPC-like-1細(xì)胞富集在丘腦腫瘤中(圖3h)。
4、H3-K27M DMG細(xì)胞群的開(kāi)放染色質(zhì)景觀
作者通過(guò)8個(gè)腫瘤的snATAC-seq來(lái)探測(cè)單核可及染色質(zhì)譜，以補(bǔ)充和驗(yàn)證單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果證明snATAC-seq與scRNA-seq衍生的細(xì)胞群基本一致，包括AC-like細(xì)胞(圖4a,b)。通過(guò)將snATAC-seq衍生的可訪問(wèn)染色質(zhì)區(qū)域/峰與scRNA-seq相關(guān)聯(lián)，測(cè)量其最接近相關(guān)基因的表達(dá)水平，確定了順式調(diào)節(jié)DNA元件(CRE)及其靶基因的13632個(gè)潛在的峰-基因鏈接(圖4c)。其中，287個(gè)基因表現(xiàn)出超過(guò)8個(gè)(前5%)相關(guān)的CRE，表示高調(diào)控位點(diǎn)復(fù)雜性，是關(guān)鍵譜系標(biāo)記基因的決定因素(圖4d，e)。OPC/OC-like細(xì)胞特異性預(yù)測(cè)染色質(zhì)(GPCs)相關(guān)的基因，表明對(duì)普遍存在的H3-K27M DMG的少突膠質(zhì)譜系進(jìn)行高度合作的調(diào)節(jié)(圖4e)，將候選GPC與H3-K27ac ChIP-seq衍生的H3-K27M原發(fā)性腫瘤的超級(jí)增強(qiáng)子譜疊加,證明了GPC與H3-K27M DMG超級(jí)增強(qiáng)子調(diào)節(jié)基因的顯著重疊(圖4f)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)含有SOX8 TF結(jié)合位點(diǎn)的16個(gè)CRE相連，進(jìn)一步預(yù)測(cè)其在OPC-like細(xì)胞中具有差異活性(圖4g,h)。所有腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的GPC的CRE中基因表達(dá)，染色質(zhì)可及性和細(xì)胞狀態(tài)特異性TF富集之間的相互依賴(lài)性，例如AC樣標(biāo)記基因ITPKB(圖4i)。這些證實(shí)了染色質(zhì)調(diào)控和基因表達(dá)在多個(gè)層面上的緊密交織和細(xì)胞狀態(tài)特異性。
5、H3-K27M DMG中的年齡特異性骨髓細(xì)胞景觀
本研究通過(guò)基因集打分將TAM分為小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(圖5a–c)，不同年齡組的小膠質(zhì)細(xì)胞與巨噬細(xì)胞比例的比較顯示，兒童DMG中的小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生率較高，而成人DMG中巨噬細(xì)胞的發(fā)生率較高(圖5d)，腫瘤位置似乎不影響這些比例。在本研究的隊(duì)列中，與兒童H3-K27M DMG相比，成人MES-like細(xì)胞的顯著富集，并在成人TAM中檢測(cè)到更高的OSM表達(dá)及相應(yīng)的受體OSMR(圖5e，f)，表明免疫介導(dǎo)途徑的參與誘導(dǎo)成人腫瘤中的MES-like表型。此外，與兒童TAM相比，觀察到成人MES-like標(biāo)記基因在間充質(zhì)富集的膠質(zhì)瘤中表達(dá)增加(圖5g)。通過(guò)分析正常小鼠腦骨髓細(xì)胞圖譜中跨年齡的基因表達(dá)，觀察到配體OSM和間充質(zhì)標(biāo)志基因隨著年齡的增長(zhǎng)而增加(圖5h)，表明H3-K27M DMG腫瘤MES-like狀態(tài)隨年齡的增長(zhǎng)與腦髓區(qū)室的變化有關(guān)，這種變化在正常發(fā)育和衰老過(guò)程中也發(fā)生。
6、繪制H3-K27M DMG的單細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)圖
在16個(gè)患者H3-K27M DMG組織切片中使用一組從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)集中收集的 116個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性組合標(biāo)記基因(圖6a-c)。通過(guò)原位測(cè)序(pciSeq)的概率細(xì)胞分型分析了空間細(xì)胞狀態(tài)組成，觀察到AC-like細(xì)胞構(gòu)成了主要的惡性細(xì)胞區(qū)室(圖6c)。相對(duì)于兒童腫瘤，成人H3-K27M DMG切片具有更高比例的MES-like腫瘤細(xì)胞(圖6d)。惡性細(xì)胞鄰域的全局分析表明，OPC-like/Cycling 和 OC-like細(xì)胞的共定位更高(圖6e)，通過(guò)多重免疫熒光(IF)成像驗(yàn)證增殖OPC-like和OC-like細(xì)胞的首選為有絲分裂生態(tài)位，被更分化的，不增殖的AC-like細(xì)胞包圍(圖6f)。通過(guò)計(jì)算聚類(lèi)系數(shù)發(fā)現(xiàn)AC-like細(xì)胞，非惡性星形膠質(zhì)細(xì)胞和TAMs與其他細(xì)胞類(lèi)型/狀態(tài)聚集的最高趨勢(shì)，暗示它們更彌漫分布，而不是局限于有限的空間區(qū)室(圖6g)。因此，在天然腫瘤組織內(nèi)解析了scRNA-seq定義的H3-K27M DMG細(xì)胞群的空間結(jié)構(gòu)，特別是表明存在有絲分裂干樣生態(tài)位，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系的H3-K27M腫瘤細(xì)胞(OPC-like和OC-like癌細(xì)胞)共定位。
本研究提供了跨空間和時(shí)間的H3-K27M DMG細(xì)胞異質(zhì)性的廣泛資源，有助于描繪時(shí)空環(huán)境特定細(xì)胞特性和微環(huán)境生態(tài)位之間的多方面相互作用，以設(shè)計(jì)合理的建模研究和治療框架，為這種致命膠質(zhì)瘤的不同臨床解剖學(xué)群體量身定制。

參考文獻(xiàn)
Liu, I., Jiang, L., Samuelsson, E.R. et al. The landscape of tumor cell states and spatial organization in H3-K27M mutant diffuse midline glioma across age and location. Nat Genet (2022).
https://doi.org/10.1038/s41588-022-01236-3.