生物芯片掃描儀和微陣列可用于抗擊傳染性疾病

 

病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)可引起有害疾病，對(duì)于這些疾病需要快速有效的檢測(cè)和治療工具。感染和致病機(jī)制鮮為人知的新傳染病是科學(xué)研究和臨床治療的巨大挑戰(zhàn)。研究病原體與宿主的相互作用、抗原表位和患者免疫反應(yīng)對(duì)于開(kāi)發(fā)新的疾病預(yù)防或治療方法（如疫苗和新藥）至關(guān)重要。同時(shí)，流行病學(xué)研究中大型患者隊(duì)列的眾多樣品，需要自動(dòng)化和高通量的樣品處理方式。值得注意的是，微陣列和 InnoScan 熒光掃描儀可用于傳染病研究的任何步驟，從病原體檢測(cè)到疫苗驗(yàn)證。使用專(zhuān)門(mén)的聚糖陣列，研究人員現(xiàn)在能夠解析病毒和細(xì)菌感染的精確機(jī)制。同樣，高密度多肽微陣列是了解免疫反應(yīng)、解析抗原表位以及設(shè)計(jì)和驗(yàn)證疫苗的寶貴工具。
 

圖1.聚糖微陣列傳染病相關(guān)應(yīng)用案例
 

微陣列是由精確排列在載體表面（通常是顯微鏡載玻片）已知位置上的生物分子（核酸、蛋白質(zhì)、多肽、聚糖等）組成的微型矩陣。將患者血清、細(xì)胞裂解物或純化的 DNA 等樣品孵育到微陣列上。然后使用 InnoScan 等熒光掃描儀，以更高的靈敏度和更寬的動(dòng)態(tài)范圍檢測(cè)熒光，收集可靠數(shù)據(jù)。微陣列優(yōu)于其他技術(shù)，因?yàn)樗鼈兡軌蛲瑫r(shí)檢測(cè)多種相互作用，具有高通量能力，可以使用少量的試劑和樣品來(lái)測(cè)試大量樣本。
 

DNA微陣列可以檢測(cè)病毒或細(xì)菌等病原體。微陣列的多指標(biāo)檢測(cè)能力允許在一張載玻片上檢測(cè)不同的病毒。一個(gè)DNA 微陣列可以同時(shí)測(cè)試 100 種不同的病毒。2015 年，Martinez¹ 等人設(shè)計(jì)了一種 DNA 微陣列，用于同時(shí)檢測(cè)與兒童胃腸炎有關(guān)的各種胃腸道病毒。作者驗(yàn)證了使用 DNA 微陣列檢測(cè) 10 種不同的病毒，其具有與RT-PCR 相似或更高的靈敏度。研究人員還指出，DNA 微陣列可用于解析一種以上病毒的共感染，有助于了解兒童胃腸炎的病因。同樣，由 Khan MJ 等人開(kāi)發(fā)的 SMAvirusChip 是一種 DNA 微陣列，旨在檢測(cè)由小型哺乳動(dòng)物和節(jié)肢動(dòng)物傳播的病毒²。SMAvirusChip v2微陣列芯片包含 8 個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域具有 15,000 個(gè)60 堿基寡核苷酸探針，能夠檢測(cè) 416 種病毒，包括登革熱 (DENV) 和寨卡病毒。作者使用連續(xù)稀釋的登革熱病毒樣品測(cè)試了 SMAvirusChip v2 的靈敏度，并將其與經(jīng)典 RT-PCR 進(jìn)行比較。結(jié)果顯示其比RT-PCR 靈敏度低10倍，檢測(cè)下限為2600 RNA 拷貝每毫升。這些研究共同證明了使用 DNA 微陣列作為患者病毒監(jiān)測(cè)和篩查工具是有效的。最近，Sultankulova 等人，設(shè)計(jì)了一種用于診斷禽病毒性疾病的寡核苷酸微陣列。他們使用 InnoScan 710 掃描儀檢測(cè)確定鳥(niǎo)類(lèi)樣本中存在不同禽病毒的熒光信號(hào)³。該實(shí)驗(yàn)成功地用于一項(xiàng)旨在了解哈薩克斯坦野生鳥(niǎo)類(lèi)中1型禽流感病毒分子流行病學(xué)的大范圍研究⁴。該研究包括來(lái)自哈薩克斯坦 9 個(gè)地區(qū) 37 個(gè)科鳥(niǎo)類(lèi)的 860 個(gè)泄殖腔拭子樣本。該項(xiàng)研究結(jié)果有希望解析病毒基因型并建立病毒傳播地圖。這項(xiàng)工作展示了 DNA 寡核苷酸微陣列作為流行病學(xué)研究和病毒監(jiān)測(cè)高通量工具的潛力。

 

使用 DNA 或蛋白質(zhì)陣列的細(xì)菌血清分型有助于區(qū)分引發(fā)不同免疫反應(yīng)的細(xì)菌。2010 年 Marimon 等人成功開(kāi)發(fā)了一款抗體微陣列來(lái)進(jìn)行肺炎鏈球菌血清分型⁵。這種蛋白質(zhì)血清分型微陣列由針對(duì) 83 或 91 肺炎鏈球菌血清特異性抗體組成。

 

特定的細(xì)菌和抗體結(jié)合之后，通過(guò)熒光抗體進(jìn)行檢測(cè)。InnoScan 710 掃描儀和 Mapix 軟件分別用于熒光信號(hào)的獲取和定量分析。與細(xì)菌血清分型的標(biāo)準(zhǔn)方法 Quellung 技術(shù)相比，抗體微陣列顯示出更好的特異性和更短的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。此外，抗體微陣列的多指標(biāo)檢測(cè)能力允許在同一實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)交叉反應(yīng)抗體，而經(jīng)典方法不具備這一能力。

 

由于缺乏特定的身體癥狀或臨床標(biāo)志物，一些疾病難以診斷。例如，上呼吸道疾病可能是由多種病毒引起，但它們具有相同的臨床癥狀。診斷困難會(huì)使患者診斷復(fù)雜化并影響流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，俄羅斯圣彼得堡 Smorodintsev 流感研究所的 Marina Plotnikova 開(kāi)發(fā)了一種抗體微陣列，能夠區(qū)分上呼吸道疾病六種常見(jiàn)病毒：IAV、IBV、RSV、hAdV、hPIV2 和 hPIV3⁶。

 

該檢測(cè)是一種基于微陣列的微縮化多重 ELISA 夾心實(shí)驗(yàn)，其檢測(cè)限略低于經(jīng)典 ELISA。該檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)在于多指標(biāo)檢測(cè)和節(jié)省時(shí)間。作者聲稱(chēng)有可能將同時(shí)檢測(cè)的病原體種類(lèi)增加到約 50 種。
 

為了開(kāi)發(fā)抵抗病原體感染的有效策略，需要研究病原體引起感染的機(jī)制。病毒感染通常由病毒蛋白（衣殼蛋白或糖蛋白）和宿主細(xì)胞表面受體之間的一種或幾種特異性相互作用引發(fā)。而細(xì)菌的發(fā)病機(jī)制是由細(xì)菌表面糖蛋白介導(dǎo)的，這有時(shí)使它們能夠逃避人體免疫系統(tǒng)。因此，通過(guò)病毒或細(xì)菌聚糖結(jié)合蛋白 (GBP) 與宿主細(xì)胞膜聚糖之間的相互作用，聚糖對(duì)于病原體致病能力至關(guān)重要。
 

 

通過(guò)聚糖微陣列可以深入了解這些相互作用，為藥物和疫苗的開(kāi)發(fā)提供線索。

 

典型的聚糖微陣列工作流程從聚糖微陣列構(gòu)建開(kāi)始。使用芯片點(diǎn)樣儀將聚糖或凝集素點(diǎn)樣在功能化修飾的載玻片表面。聚糖和凝集素分子通過(guò)共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)鍵吸附和芯片表面進(jìn)行固定，這取決于芯片表面的修飾類(lèi)型。該聚糖陣列用于從樣品中捕獲聚糖結(jié)合分子例如聚糖結(jié)合蛋白、病毒、細(xì)胞或其他。熒光染料可用于檢測(cè)聚糖結(jié)合蛋白和聚糖之間的相互作用。在孵育步驟之前將聚糖結(jié)合蛋白與熒光基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)，或孵育步驟完成后，在附加步驟中使用針對(duì)聚糖結(jié)合蛋白的熒光抗體。然后使用微陣列掃描儀檢測(cè)熒光。 Innopsys InnoScan 是自動(dòng)化熒光檢測(cè)的理想工具，能夠同時(shí)檢測(cè)兩種或三種熒光信號(hào)，其Mapix 軟件通過(guò)圖像分析來(lái)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行自動(dòng)化的定量分析（圖2）。Scripps研究所 McBride 等人開(kāi)發(fā)了一款含48個(gè)微陣列的載玻片芯片來(lái)監(jiān)測(cè)甲型流感病毒血凝素親和力的特異性⁷。該微陣列可同時(shí)檢測(cè) 6 種不同聚糖與 6種聚糖結(jié)合蛋白在8種稀釋條件下的相互作用。該檢測(cè)旨在監(jiān)測(cè)禽類(lèi)病毒是否正在適應(yīng)人類(lèi)受體。作者使用 InnoScan 1100 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。他們使用三個(gè)熒光通道的同時(shí)檢測(cè)來(lái)跟蹤芯片上三種不同類(lèi)型的樣品點(diǎn)：他們?cè)谖㈥嚵兄谱鬟^(guò)程中使用 Atto488-NHS 染料作為網(wǎng)格標(biāo)記，使用鏈霉親和素-555 染料來(lái)檢測(cè)具有已知特異性且生物素標(biāo)記的凝集素作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照；用Alexa 647 標(biāo)記的抗體，來(lái)檢測(cè)甲型流感病毒血凝素的受體結(jié)合特異性。由此產(chǎn)生的檢測(cè)結(jié)果與微孔板檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，但化學(xué)試劑和生物試劑的消耗量分別顯著減少 1,500 倍和 360 倍（圖 3）。凝集素調(diào)節(jié)病毒，細(xì)菌對(duì)宿主組織的粘附，介導(dǎo)定植和感染。細(xì)菌與宿主組織相互作用的研究對(duì)于了解和預(yù)防細(xì)菌感染至關(guān)重要。由于聚糖是復(fù)雜的分子，我們需要能夠有效研究聚糖與凝集素極其復(fù)雜多樣相互作用的方法。使用完整細(xì)胞的聚糖微陣列是解析幾種細(xì)菌凝集素與宿主聚糖結(jié)構(gòu)相互作用的有效工具。使用熒光標(biāo)記的完整細(xì)菌而不是純化的蛋白質(zhì)，研究人員能夠跟蹤細(xì)菌凝集素與宿主候選聚糖結(jié)構(gòu)的相互作用。

 

 

De Olivera 等人⁸ 使用全細(xì)胞聚糖陣列揭示了化膿性鏈球菌感染率的高低與宿主糖基化結(jié)構(gòu)多樣性相關(guān)。他們發(fā)現(xiàn)M1細(xì)菌蛋白對(duì)幾種末端半乳糖血型抗原結(jié)構(gòu)顯示出高親和力。細(xì)菌對(duì)宿主細(xì)胞的粘附與血型抗原的表達(dá)有關(guān)，這解釋了宿主血型抗原表達(dá)與A組鏈球菌M1T1克隆(GAS)定植之間的關(guān)系。

 

最近，臥龍崗大學(xué)和昆士蘭大學(xué)的研究人員與澳大利亞格里菲斯大學(xué)的糖組學(xué)研究所合作，發(fā)表了如何構(gòu)建聚糖陣列并研究 GAS 與宿主聚糖結(jié)構(gòu)相互作用的完整方法⁹。他們使用 InnoScan 1100 檢測(cè)熒光標(biāo)記的純化蛋白或熒光標(biāo)記的完整細(xì)菌。

 

使用完整細(xì)菌的聚糖微陣列可以更全面地分析細(xì)菌對(duì)宿主器官的粘附和定植。
 

在感染過(guò)程中，病原體與宿主的相互作用會(huì)觸發(fā)宿主免疫反應(yīng)，以控制病原體的定植和感染。先天免疫反應(yīng)包括促炎分子如細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。這種對(duì)病原體的非特異性反應(yīng)是一種快速且通常有效的控制感染過(guò)程。當(dāng)病原體成功逃避先天免疫反應(yīng)時(shí)，T細(xì)胞和B細(xì)胞等特化免疫細(xì)胞被激活，從而啟動(dòng)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。因此，炎癥是對(duì)抗感染因子的首要機(jī)制之一。然而，加劇和不受控制的炎癥會(huì)導(dǎo)致宿主組織損傷。細(xì)胞因子和趨化因子分泌分析有助于理解先天免疫反應(yīng)機(jī)制，并有助于深入了解如何控制炎癥和避免組織損傷。中國(guó)石家莊愛(ài)爾眼科醫(yī)院的研究人員使用抗體微陣列和 InnoScan 300-G（現(xiàn)為 InnoScan 710-G）來(lái)研究人類(lèi)角質(zhì)細(xì)胞在 1 型單純皰疹病毒 (HSV-1) 感染期間分泌的細(xì)胞因子¹⁰。他們能夠確定相比未感染角質(zhì)細(xì)胞，18 種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子在HSV-1 刺激的角質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)為控制 HSV-1 感染和避免先天免疫反應(yīng)失衡所引起的過(guò)度疤痕和組織損傷，提供治療相關(guān)洞見(jiàn)。
 

InnoScan 710 適用于中高密度的芯片	InnoScan 1100 適用于超高密度的芯片

 

Innopsys 成立于1999年。總部位于法國(guó)。分部設(shè)立于美國(guó)的芝加哥。一直致力于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。Innoscan系列掃描儀，采用先進(jìn)的多共聚焦掃PMT檢測(cè)器和多激光掃描光路，可以同時(shí)進(jìn)行多通道檢測(cè)。不僅有效降低了熒光光漂白現(xiàn)象以及信號(hào)損失，還可以有效的縮短掃描時(shí)間。掃描過(guò)程中，可實(shí)時(shí)自動(dòng)聚焦。根據(jù)芯片片基高度變化，自動(dòng)調(diào)節(jié)焦距以獲得最佳掃描結(jié)果。Innoscan系列不僅是擁有快速、高分辨率和靈活等特點(diǎn)的掃描儀產(chǎn)品系列，更是基因、蛋白、糖類(lèi)、細(xì)胞、組織等多種芯片研究的強(qiáng)大工具。在基因組和蛋白組表達(dá)，基因突變，SNP檢測(cè)，CGH，細(xì)菌病毒檢測(cè)，腫瘤特異性標(biāo)志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應(yīng)用。 

 

環(huán)亞生物，生命科學(xué)產(chǎn)品全國(guó)性代理商，不斷把國(guó)外頂級(jí)的創(chuàng)新產(chǎn)品引入中國(guó)。環(huán)亞生物具備完善的公司運(yùn)營(yíng)、產(chǎn)品管理、營(yíng)銷(xiāo)、售前技術(shù)支持和售后維修體系。環(huán)亞生物作為Innoscan大中華區(qū)代理商，負(fù)責(zé)Innoscan產(chǎn)品大中華區(qū)的營(yíng)銷(xiāo)和售后支持。
 

1.Martínez MA, Soto-del Río MDLD, et al. 2015. DNA microarray for detection of gastrointestinal  viruses. J Clin Microbiol53:136–145.   DOI:10.1128/JCM.01317-14

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