MicroFab的應(yīng)用：對哺乳動物細胞按需噴墨實現(xiàn)細胞級精度生物打印

浦項科技大學(xué)相關(guān)研究人員通過MicroFab的Jetlab®Ⅱ噴墨打印系統(tǒng)對哺乳動物細胞進行了按需噴墨（DOD）的微陣列打印，并采用MicroFab的30μm、50μm和80μm噴頭搭建了微液滴發(fā)生裝置，進行了對噴射的哺乳動物細胞液滴的觀測和研究。噴墨打印后的細胞存活率與未打印的對照組一致。

介紹

活細胞和生物材料的直接打印，也稱為“生物打印”，為組織工程和再生醫(yī)學(xué)打開了新的大門，代表了傳統(tǒng)的基于預(yù)成型支架的組織工程的突破。鑒于生物打印能夠?qū)⒓毎�和生物材料放置在具有適當細胞組成和密度的預(yù)定位置，2D細胞圖案或3D結(jié)構(gòu)的制造取得了巨大進展，例如皮膚、耳朵、軟骨等。除了簡單或薄的結(jié)構(gòu)之外，還出現(xiàn)了對通過準確和精確的細胞打印來模擬天然復(fù)雜和厚的器官在天然組織長度尺度（10μm~100μm）上具有異質(zhì)性的正常功能但高度復(fù)雜、分層和分層結(jié)構(gòu)的需求。復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)也需要細胞級精度。這些活組織和器官在組織學(xué)上是涉及細胞外基質(zhì)蛋白的多細胞構(gòu)建體，它們各自的功能可以通過微環(huán)境表達，微環(huán)境對3D空間中這些組件之間的相互作用很敏感。因此，穩(wěn)定可靠地控制3D空間中細胞和生物材料的空間位置和排列對于高分辨率至關(guān)重要，該分辨率幾乎等于生物結(jié)構(gòu)和功能組織的微觀組織結(jié)構(gòu)。

為確保生物打印能夠形成精心設(shè)計的架構(gòu)，已推出各種類型的打印機，例如按需噴墨（DOD）、微擠壓、激光輔助和電流體動力（EHD）等。在這些生物打印技術(shù)中，DOD噴墨打印已被證明是一種有前途的方法，可根據(jù)需要精確沉積受控體積的載有細胞的液滴。鑒于需要精確微小液滴沉積的空間濃度梯度在生物技術(shù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如在工程微環(huán)境中，已通過使用30μm噴頭打印生長因子的空間濃度梯度來探索固定生長因子上的細胞行為。在合成細菌細胞間多細胞相互作用的研究中，也已使用21.5μm噴頭打印約2μm長的熒光蛋白和大腸桿菌的濃度梯度。此外，單個細胞的隨機或自動噴射可以在具有所需細胞密度的3D空間中引發(fā)帶狀組織。

然而，高分辨率或微小液滴體積的名聲已被普遍采用的大直徑噴頭所削弱，為了實現(xiàn)直徑范圍為15~20μm的哺乳動物細胞的高分辨率打印，具體情況見表一

^a細胞活力通過對照正�；�或與對照進行比較。

在這項工作中，研究團隊使用了一個MicroFab的30μm噴頭打印NIH/3T3和HEK293A細胞，目的是實現(xiàn)細胞級精度，并研究打印過程。在評估了NIH/3T3細胞生物墨水的流體特性（例如剪切粘度和動態(tài)表面張力）后，研究人員使用高速成像技術(shù)分析了噴頭內(nèi)的細胞運動和射流形成。使用用于形成無衛(wèi)星單滴的優(yōu)化打印條件，將一系列細胞打印到玻璃基板上，以計算打印的皮升液滴輸送的細胞數(shù)量。此外，系統(tǒng)地研究了細胞濃度、不同大小的細胞類型和噴頭直徑對細胞數(shù)分布的影響。最后，用live/dead和CCK-8測定以及顯微鏡觀察檢查了印后細胞活力、增殖和形態(tài)學(xué)細胞特征。
 

實驗設(shè)備

用于高速可視化皮升液滴的自制噴墨打印設(shè)備，如下圖所示。

▲ 細胞打印和單閃頻閃成像裝置示意圖。生物墨水通過噴頭直徑為30μm的MicroFab壓電噴頭噴射。

MicroFab的壓電打印噴頭能產(chǎn)生滿足要求的皮升級微液滴。采用噴頭孔徑分別為30μm、50μm和80μm。從數(shù)據(jù)采集板的模擬輸出端口生成兩個模擬波形。驅(qū)動波形由MicroFab的CT-M3-04電壓脈沖控制器生成。驅(qū)動波形用的脈沖持續(xù)時間和電壓控制幅度分別為40μs~61μs和30V~68V。放大后，脈沖被施加到噴頭中的壓電換能器以噴射液滴。另一個模擬脈沖被發(fā)送到一個高分辨率、每像素0.74μm的CCD相機和一個持續(xù)時間非常短的納米閃光燈（150ns）通過用于單次閃光高速攝影的數(shù)字延遲。圖像以每秒5-10幀（fps）的速率獲取。還通過使用商用高速相機成像以100000fps的記錄速率和光纖耦合鹵素燈獲得了連續(xù)高速圖像。發(fā)射頻率設(shè)置為50Hz~200Hz。

使用Jetlab®Ⅱ噴墨打印系統(tǒng)來計算每個打印液滴中的細胞數(shù)。分別用30μm、50μm和80μm口徑的噴頭打印20×20的點陣列。再用30μm口徑的噴頭打印360×360的點陣列，用于驗證此噴墨技術(shù)的穩(wěn)定性。所有實驗均在1000級潔凈室進行，以確保環(huán)境無塵無菌。

▲ MicroFab高精度納米材料沉積噴墨打印系統(tǒng)Jetlab®Ⅱ

實驗結(jié)果

噴頭內(nèi)的細胞軌跡

將細胞轉(zhuǎn)移到玻璃毛細管噴頭后，在噴射過程中跟蹤它們在噴頭內(nèi)的運動。下圖顯示了用高速相機記錄下的細胞向下移動到噴頭口的運動過程。噴射頻率設(shè)置為5Hz，通過使用短持續(xù)時間頻閃和高分辨率CCD相機獲取高質(zhì)量圖像。

在不同噴射時間拍攝的高速圖像顯示，細胞在向下移向噴頭孔徑時加速，由于風險效應(yīng)或伯努利原理，噴頭孔徑逐漸縮小。上圖a顯示，沿中心的細胞（黃色虛線圓圈）比靠近壁的細胞（紅色虛線圓圈）更快地移動到孔徑。上圖b顯示，細胞的移動速度的差異是由噴頭中的速度分布引起的，由于壁處沒有滑動條件，它被推測為拋物線分布。

此外，細胞遷移是由脈沖壓力和重力驅(qū)動的。細胞運動不是連續(xù)的，但是當壓電致動器產(chǎn)生脈沖壓力以產(chǎn)生液滴時，細胞會進行去停運動。當噴頭啟動并分配約10pL的液滴體積時，生物墨水重新填充到孔口，細胞立即移動。一滴噴射后，隨著彎液面振蕩衰減，細胞略有波動。對于頻閃的一個間隔步驟，單元的平均速度和瞬時速度預(yù)期分別為Vcell,avg=Δl/Δtinterval∼10μm/0.1s=100μm/s和Vcell,max=Δl/Δtpulse∼10μm/10μs=1m/s。相反，雖然儲層中的細胞在恒定重力的影響下緩慢沉降，但事實證明，重力對噴頭中細胞運動的影響可以忽略不計。基于將細胞視為剛性球體的假設(shè)，根據(jù)斯托克斯定律，單元的自由沉降速度（Vg）的值為

其中g(shù)、ρc、ρb、a和μb分別是重力加速度、細胞和生物墨水的密度、細胞半徑和生物墨水在低剪切速率下的動態(tài)粘度。該Vg被預(yù)測為2.5μm每秒，這意味著重力不占主導(dǎo)地位，并且細胞的移動行為與噴射體積密切相關(guān)。

單滴形成

下圖顯示了單次閃光圖像，顯示在低電壓驅(qū)動下細胞懸浮液單滴形成的演變。在脈沖持續(xù)期間，噴頭開始出現(xiàn)噴射頭，在施加波形后，噴射韌帶變窄，直至最終解體。斷裂后，短韌帶縮回頭部，最終形成穩(wěn)定的球狀水滴并擺動。下圖b表明穩(wěn)定打印保持在約1.3×105滴。通過使用X-Y移動臺，將單個液滴圖案化到玻璃基板上，液滴間距為120μm。

單滴形成對于確保穩(wěn)定和可重復(fù)的細胞打印至關(guān)重要。通常，細胞以不規(guī)則的方式影響射流的形態(tài)。特別是在長韌帶的情況下，噴射韌帶（包括細胞）的形態(tài)是異常的，因為與變薄的韌帶相比，細胞的直徑更大。但是，如果細胞位于主頭部，則形態(tài)穩(wěn)定且規(guī)則，與沒有細胞的射流形態(tài)無法區(qū)分。射流形態(tài)和打印性能（例如，液滴直徑和速度）可以通過輸入波形的形狀進行調(diào)制。

通過之前的實驗進行分析。最終結(jié)果表明，與常用的較大噴頭直徑相比，30μm的小噴頭直徑可以實現(xiàn)更高百分比的單細胞打印。

細胞活力和增殖

使用live/dead測定法測定打印后立即存活率、CCK-8測定法測定細胞生長率和Hoechst 33342染色測定細胞形態(tài)，研究通過小噴頭噴射對細胞活力和增殖的影響。首先，下圖a通過基于live/dead檢測試劑盒自動分析綠色和紅色染色的細胞群來顯示細胞活力。

作為對照，移液到孔中的細胞的存活率為96.2%，從30μm和80μm噴頭噴射的細胞的存活率分別為94.4%和96.3%。這種高存活率與先前關(guān)于使用較大噴頭尺寸的基于噴墨的細胞打印的研究報告的結(jié)果一致。接下來，進行CCK-8測定以研究在達到平臺期之前的7天小噴頭直徑是否影響細胞的體外增殖。盡管由于最初接種的細胞數(shù)（數(shù)據(jù)未顯示），每組之間的細胞數(shù)有所不同，但這些細胞培養(yǎng)組顯示出與上圖b中代表細胞生長速率的曲線斜率相同的細胞生長趨勢。基于采用自然生長規(guī)律的簡單細胞群模型，表示為

P(t) = P0ekt, 

其中t、P0和k分別代表培養(yǎng)時間（天）、初始種群和（人均）增長率；每個組中的細胞在第1天以與每個初始群體相似的增長率呈指數(shù)增長。最后，進行細胞形態(tài)學(xué)檢查以進行定性分析。如上圖c所示，未觀察到明顯的形態(tài)異常和DNA斷裂；此外，這些打印的細胞仍然保持良好的對基材的粘附能力。這些結(jié)果表明，30μm噴墨噴頭對打印的哺乳動物細胞的影響和損害可以忽略不計。

實驗結(jié)論

研究團隊展示了基于DOD噴墨的細胞打印，30μm噴頭可實現(xiàn)細胞級精度。高速成像技術(shù)表明，噴頭內(nèi)的細胞在壓電致動器產(chǎn)生的脈沖壓力下在噴頭內(nèi)進行往復(fù)運動。在評估了載有細胞的生物墨水的流體特性后，優(yōu)化了打印條件以生成沒有衛(wèi)星的載有細胞的單滴。結(jié)果表明，液滴中的細胞數(shù)量受噴頭尺寸（ 30、50和80μm）和細胞濃度（2.5×106個細胞/ml和5.0×106個細胞/ml）的影響很大，而打印不同的細胞類型在數(shù)量上幾乎沒有變化。30μm噴墨噴頭能夠在5.0×106個細胞/ml的細胞濃度下平均每滴打印1.3個哺乳動物細胞。更大的噴頭允許更多的細胞通過。分別使用live/dead檢測試劑盒、CCK-8檢測和細胞形態(tài)成像檢測細胞的活力、增殖和形態(tài)。研究團隊發(fā)現(xiàn)用非常小的噴頭打印后的細胞存活率與未打印的對照一致。噴墨打印非常適合活細胞的沉積，因為它專為精確沉積皮升體積的載有細胞的液滴而設(shè)計。此外，使用一個30μm噴頭可以幫助最大化噴墨技術(shù)，以細胞級精度精確沉積生物墨水。

資料來源：[1] Kim Y K ,  Park J A ,  Yoon W H , et al. Drop-on-demand inkjet-based cell printing with 30-μm nozzle diameter for cell-level accuracy[J]. Biomicrofluidics, 2016, 10(6):064110.