原代細(xì)胞培養(yǎng)過程可能出現(xiàn)的問題及解決辦法

原代細(xì)胞培養(yǎng)過程中會(huì)出現(xiàn)這樣或那樣的問題，客戶遇到的問題從細(xì)胞生長角度來說，針對(duì)細(xì)胞不貼壁、生長緩慢、生長不好，甚至死亡的原因，我們做以下分析并提出相對(duì)應(yīng)的解決方法。

一、培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁

可能原因：

●胰蛋白酶消化過度

●支原體污染

●培養(yǎng)基pH值過堿（NaHCO3分解）

●細(xì)胞老化

●接種細(xì)胞起始濃度太低或太高

解決方法：

●縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度

●分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架或培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

●使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2

●啟用新的保種細(xì)胞

●調(diào)節(jié)*接種細(xì)胞濃度

二、懸浮細(xì)胞成簇

可能原因：

●培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子；

●支原體污染；

●蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解；

●DNA污染

解決方法：

●用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕巧吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液；

●分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體；

●用DNaseI處理細(xì)胞

三、培養(yǎng)原代細(xì)胞生長緩慢

可能原因：

●由于更換不同培養(yǎng)液或血清；

●培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞；

●培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染；

●試劑保存不當(dāng)；

●接種細(xì)胞起始濃度太低；

●細(xì)胞已老化；

●支原體污染

解決方法：

●比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)，讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液；

●換入新鮮配置培養(yǎng)液，或補(bǔ)加谷氨酰胺及生長因子；

●用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物；

●血清需保存在-10到-20℃。培養(yǎng)液需在2-8℃避光保存。含血清*培養(yǎng)液在2-8℃保存，需在1周內(nèi)用完；

●增加接種細(xì)胞起始濃度；

●換用新的保種細(xì)胞；

●分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。

四、培養(yǎng)細(xì)胞生長不好

可能原因：

●細(xì)胞本身的狀態(tài)

細(xì)胞傳代次數(shù)多，細(xì)胞老化；

細(xì)胞的接種量：接種量過低，細(xì)胞生長緩慢；

細(xì)胞傳代時(shí)間過晚：細(xì)胞中毒，影響傳代后的細(xì)胞生長；

胰酶消化時(shí)間過長或過短：時(shí)間過長，細(xì)胞死亡；時(shí)間過短，細(xì)胞未*分離而成團(tuán)，細(xì)胞死亡；

細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇：慢凍速融。

●污染

支原體污染

霉菌污染

●培養(yǎng)基或血清

更換血清或培養(yǎng)基之前未進(jìn)行驗(yàn)證

選擇的培養(yǎng)基是否合適

培養(yǎng)基配制是否準(zhǔn)確無誤

●原代細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

CO2供應(yīng)是否正常

培養(yǎng)箱或搖床溫度控制是否正確