項(xiàng)目文章： 單細(xì)胞測序揭示共刺激分子CD226對胸腺T細(xì)胞發(fā)育的影響

2022年11月，第四軍醫(yī)大學(xué)聯(lián)合西北工業(yè)大學(xué)在學(xué)術(shù)期刊IMMUNOLOGY上發(fā)表題為“CD226 knockout reduces the development of CD8+ T by impairing the TCR sensitivity of double-positive thymocytes”的研究成果。本研究通過對野生型(WT)和CD226基因敲除小鼠(KO)的胸腺細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序，探索了共刺激分子CD226對于T細(xì)胞發(fā)育的重要作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD226KO小鼠胸腺中CD8+ T細(xì)胞顯著減少，DPT-Q細(xì)胞顯著增加，并且削弱了TCR信號(hào)通路中AKT的磷酸化水平，促進(jìn)DPT細(xì)胞凋亡，表明CD226對胸腺細(xì)胞發(fā)育有重要影響。新格元在該研究中承擔(dān)了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序以及單細(xì)胞數(shù)據(jù)生信分析等工作。
 
研究背景
T淋巴細(xì)胞在胸腺發(fā)育成熟，其經(jīng)歷的陽性選擇是表達(dá)不同TCRs的未成熟雙陽性(DP) T細(xì)胞成熟為MHC限制性單陽性(SP) T細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。CD226是一種I型跨膜活化性受體，以往對CD226功能的研究主要集中在外周組織中調(diào)節(jié)免疫的作用。CD226信號(hào)通路促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞活化，增強(qiáng)細(xì)胞毒性，它對抗腫瘤免疫至關(guān)重要，但在胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中其特征尚不明確。
DPT：共表達(dá)CD4/CD8，雙陽性T細(xì)胞(DPT)；
DPT-Q：DPT at the quiescent phase靜止期的DPT細(xì)胞；
DPT-P：DPT at proliferating phase增殖期的DPT細(xì)胞；
DNT：雙陰性T細(xì)胞。
   
研究結(jié)果
1.scRNA-seq揭示了CD226在胸腺T細(xì)胞發(fā)育中的意義
為了確定CD226分子在胸腺T細(xì)胞發(fā)育中的作用，研究者使用Singleron GEXSCOPE平臺(tái)對5周齡CD226 KO小鼠和對照的野生型(WT)小鼠的胸腺細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq(圖1a)。通過質(zhì)量控制并分別獲得了26962個(gè)(WT)和26283個(gè)(KO)胸腺細(xì)胞；利用UMAP對細(xì)胞群進(jìn)行識(shí)別和可視化，大多數(shù)胸腺細(xì)胞被鑒定為T細(xì)胞(圖1b)。然后將T細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分聚類為7個(gè)亞群，然后使用之前報(bào)道的marker進(jìn)行了注釋(圖1c)，并對T細(xì)胞每個(gè)cluster的前10個(gè)特征基因進(jìn)行了展示。擬時(shí)序分析顯示，WT和CD226KO小鼠的胸腺細(xì)胞發(fā)育軌跡如下：DNT、DPT-P、DPT-Q、CD4+/CD8+ SP T細(xì)胞(CD4/CD8 T)(圖1c,e)，這與前人的報(bào)道一致。
CD226 KO組胸腺細(xì)胞各亞群的分布和比例發(fā)生了顯著變化(圖2a)。與WT小鼠相比，CD226KO小鼠的CD8+ SP胸腺細(xì)胞比例顯著降低，DPT-Q細(xì)胞比例顯著增加(圖2a,b)。然后，研究者又通過流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)，CD226敲除降低了胸腺中CD8 T細(xì)胞的比例，增加了DPT細(xì)胞的比例(圖2c)。通過對DPT-Q、CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞進(jìn)行Monocle 2擬時(shí)序表明，CD226敲除一定程度上阻止DPT-Q分化為CD8+ T細(xì)胞(圖2d,e)。提示CD226在胸腺T細(xì)胞的發(fā)育過程中起重要作用，尤其是在DPT-Q向CD8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中。
2.CD226在DPT期開始高表達(dá) 
基于CD226在胸腺T細(xì)胞發(fā)育中的重要作用，研究者檢測了WT小鼠中不同發(fā)育階段的T細(xì)胞中CD226的表達(dá)情況。首先是通過jitter圖顯示了在T細(xì)胞分化的假時(shí)間過程中CD226的表達(dá)(圖3a)，發(fā)現(xiàn)：CD226不表達(dá)于DNT期之前的各階段胸腺細(xì)胞，在DPT-Q期開始表達(dá)，在CD4+、CD8+和NKT細(xì)胞等終末分化T細(xì)胞中表達(dá)最高。接著，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測WT小鼠胸腺中CD226蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)：CD226水平按照DNT、DPT、CD4+ T和CD8+ T細(xì)胞的順序逐漸升高，其中CD226在DNT中表達(dá)最低，但在DPT期顯著升高(圖3b,c)。這表明CD226在DPT細(xì)胞中起重要作用。此外，CD8+ T細(xì)胞中CD226的表達(dá)顯著高于其他亞群，這可能是CD226敲除主要影響了CD8+ T細(xì)胞發(fā)育和功能的原因之一。
CD226敲除抑制DPT-Q向CD8+ T細(xì)胞的發(fā)育，DPT-Q是T細(xì)胞向SP細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵階段。接下來，文章作者進(jìn)一步對DPT-Q細(xì)胞展開研究。首先將DPT-Q細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分群，分為5個(gè)亞群，使用UMAP進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和可視化(圖4a)。通過UMAP圖可以看出，CD226敲除導(dǎo)致DPT-Q中缺少簇2、3和5(圖4c)。同時(shí)作者也對這些亞群的特征基因以熱圖的形式進(jìn)行了展示。簇2可以由Granzyme A (Gzma)注釋(圖4e)，而Granzyme A是一種選擇性地表達(dá)于CTL和NK細(xì)胞的絲氨酸蛋白酶，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞死亡，表明Gzma+ Cluster 2可能進(jìn)一步發(fā)展為CD8+ T細(xì)胞。這些結(jié)果表明，CD226敲除抑制DPT-Q的發(fā)育，Gzma+亞群的缺失可能是CD8+ T發(fā)育障礙的潛在原因。
3.CD226的缺失通過減弱TCR信號(hào)強(qiáng)度阻礙了T細(xì)胞的陽性選擇
DPT-Q期的陽性選擇對T細(xì)胞向SP(單陽性)細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要，DPT細(xì)胞只有接收到合適強(qiáng)度的TCR信號(hào)，才能通過陽性選擇，繼續(xù)存活和成熟。CD5的水平在陽性選擇過程中受到嚴(yán)格的調(diào)控，并且CD5的表達(dá)反映了TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的強(qiáng)度，CD5+ Cluster 3被鑒定為正在發(fā)生陽性選擇的DPT細(xì)胞。接下來，文章作者對CD5+ Cluster 3細(xì)胞展開了研究，jitter圖顯示CD5表達(dá)增加，之后隨擬時(shí)序順序降低，反映了DPT細(xì)胞經(jīng)歷陽性選擇的動(dòng)態(tài)過程(圖5a)。鑒于CD226敲除造成CD5+ Cluster 3細(xì)胞的顯著減少(圖4c)，文章作者進(jìn)一步研究了CD226是否影響DPT細(xì)胞的TCR信號(hào)強(qiáng)度�；�于scRNA-seq的氣泡圖顯示，CD226 KO小鼠的DPT-Q和CD5+ DPT-Q細(xì)胞中TCR下游信號(hào)分子如Lck、Lat和Zap70的基因表達(dá)均下調(diào)(圖5b)。WT和CD226 KO 組DPT細(xì)胞之間差異基因的富集分析指向TCR下游的MAPK等相關(guān)信號(hào)通路(圖5c)。GO富集分析也顯示了TCR信號(hào)的一致結(jié)果，如分子功能中的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶結(jié)合，細(xì)胞成分中的細(xì)胞質(zhì)，以及生物過程中的細(xì)胞分化(圖5d)。
4.CD226通過調(diào)控AKT活性調(diào)控DPT細(xì)胞凋亡
細(xì)胞凋亡是胸腺細(xì)胞進(jìn)行陽性選擇和決定成熟單陽性T細(xì)胞數(shù)量的最重要機(jī)制，研究者通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了WT和CD226KO小鼠胸腺細(xì)胞凋亡水平。WT胸腺細(xì)胞和CD226KO胸腺細(xì)胞中CD4+和CD8+ SP細(xì)胞的百分比沒有顯著差異，而CD226缺陷的DPT細(xì)胞顯示出更高的凋亡水平(圖6a)。
AKT通路參與細(xì)胞存活/凋亡的調(diào)節(jié)，當(dāng)TCR被激活時(shí)，其下游元件NF-κB、AKT和MAPK發(fā)生級聯(lián)磷酸化。然而，在CD226缺陷的DPT細(xì)胞中，AKT在Ser473位點(diǎn)的磷酸化、ERK在Thr202/ Tyr204位點(diǎn)的磷酸化、NF-κB在Ser536位點(diǎn)的磷酸化和P38在Thr180/Tyr182位點(diǎn)的磷酸化顯著降低(圖6b)。與WT DPT細(xì)胞相比，CD226缺陷的DPT細(xì)胞表現(xiàn)出更高的凋亡水平，AKT激活劑SC79顯著逆轉(zhuǎn)了這種凋亡水平(圖6c)。
同時(shí)，促凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved-caspase 3在CD226缺陷的DPT細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。AKT抑制劑增強(qiáng)了DPT細(xì)胞中Bax和cleaved-caspase 3的表達(dá)，AKT激活劑顯著逆轉(zhuǎn)了CD226缺陷的DPT細(xì)胞中Bax和cleaved-caspase 3的上調(diào)(圖6d)。上述結(jié)果表明，CD226可以通過調(diào)節(jié)AKT活性來調(diào)控DPT細(xì)胞凋亡，TCR信號(hào)強(qiáng)度減弱是CD226 KO小鼠陽性選擇受損和胸腺細(xì)胞發(fā)育障礙的原因。  
結(jié)論
1、本研究對WT和CD226 KO小鼠胸腺細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測序，CD226KO小鼠胸腺中CD8+ T細(xì)胞顯著減少，DPT-Q細(xì)胞顯著增加，表明CD226對胸腺細(xì)胞發(fā)育有重要影響。
2、研究了CD226在胸腺細(xì)胞各發(fā)育階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其在DPT時(shí)期開始高表達(dá)。
3、DPT-Q細(xì)胞被細(xì)分為5個(gè)細(xì)胞亞群，包括CD5高表達(dá)的細(xì)胞群，而CD226 KO組胸腺中明顯缺乏CD5表達(dá)，而另一簇Gzma+ DPT-Q亞群在CD226 KO胸腺中同樣缺失，表明DPT-Q向CD8+ T細(xì)胞發(fā)育過程受損。
4、CD226 KO降低了多個(gè)TCR下游分子基因的表達(dá)，CD226缺陷導(dǎo)致多個(gè)TCR信號(hào)通路相關(guān)的差異基因富集，包括MAPK通路。
5、通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD226敲除增加了DPT細(xì)胞的凋亡水平，而AKT激活劑可以在很大程度上逆轉(zhuǎn)CD226缺失的DPT細(xì)胞的凋亡增加。
綜上所述，CD226在DPT細(xì)胞陽性選擇過程中協(xié)同pMHC-TCR相互作用，為DPT-Q細(xì)胞向SP階段的發(fā)育提供足夠強(qiáng)度的刺激信號(hào)，其分子機(jī)制與AKT通路抑制DPT細(xì)胞凋亡有關(guān)，參與胸腺細(xì)胞發(fā)育的調(diào)節(jié)。該發(fā)現(xiàn)為共刺激分子CD226在T細(xì)胞分化和成熟中的調(diào)節(jié)作用研究提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和思路。
 
參考文獻(xiàn)
Jingchang Ma ，Yitian Liu ， Chujun Duan  et al.  CD226 knockout reduces the development of CD8+ T by impairing the TCR sensitivity of double-positive thymocytes. Immunology. 2022 Nov 24. doi: 10.1111/imm.13612.