生物納米孔分析技術(shù)的應(yīng)用、發(fā)展及展望

生物納米孔傳感器背景介紹
生物細(xì)胞新陳代謝所涉及的無機離子、葡萄糖、核酸、氨基酸 、蛋白質(zhì)及其它細(xì)胞代謝物的跨膜運輸主要是通過生物膜上的特定的膜通道蛋白來介導(dǎo)完成的。這些膜通道蛋白是由蛋白質(zhì)單體或多聚體于生物膜上自發(fā)組裝形成的跨膜孔道，是生物細(xì)胞在數(shù)十億年的漫長生物進化過程篩選出一系列結(jié)構(gòu)最為精簡、運轉(zhuǎn)最為高效的跨膜輸運機制。
 
最近備受大家關(guān)注的著名結(jié)構(gòu)生物學(xué)家顏寧教授的主要研究工作就是細(xì)胞膜上的各種物質(zhì)運輸和信號傳導(dǎo)的跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)與功能�？茖W(xué)家們也已將跨膜蛋白改造成為用途各異的生物傳感器，用于檢測分析各類生物活性的分子。
 
生物納米孔(蛋白納米孔)，是指一種可以嵌入到細(xì)胞膜中，形成貫穿膜兩側(cè)的納米尺度孔隙，并作為離子或分子通道的跨膜蛋白。生物納米孔是由蛋白質(zhì)亞單位、肽等嵌入到脂質(zhì)雙層或聚合物膜中自組裝形成的。例如，第一種被廣泛應(yīng)用的生物納米孔α⁃溶血素納米孔(α⁃hemolysin，α⁃HL)(圖1)，是由金黃色葡萄球菌分泌的外毒素α⁃溶血素，插入到磷脂雙分子層膜中自組裝形成的蘑菇狀七聚體，該聚合體中間形成了貫穿膜的孔隙，在最窄的點形成寬度為1.4nm的納米通道。α⁃HL通道的內(nèi)徑和單鏈DNA(ssDNA)分子的直徑非常接近(為1.3nm)，使其可用于分析單鏈DNA分子。
   
生物納米孔傳感器工作原理
科學(xué)家們將納米孔蛋白嵌入到高電阻率的膜上(生物膜或高分子聚合物膜)，開發(fā)出了可用于分析單個分子的傳感器。使用生物納米孔對單個分子進行分析是建立在膜片鉗技術(shù)基礎(chǔ)上的膜通道仿生技術(shù)(圖2)。其基本原理為在高絕緣性的膜兩側(cè)充滿離子溶液，納米孔蛋白在膜上形成貫穿兩側(cè)的納米尺度的孔道，當(dāng)在膜兩側(cè)施加電壓時，離子會流過絕緣膜上的納米孔，從而產(chǎn)生恒定電流。由于生物納米孔的直徑多為1.0~3.0nm，因此在電場力驅(qū)動下只能容許一定物理尺寸的單個待測物分子進入并穿過納米孔，當(dāng)單分子通過納米孔的縮頸時會阻擋恒定的離子流(電阻抗效應(yīng))，進而造成電流的下降，下降的幅度和延續(xù)的時間與通過納米孔的單分子的粒徑、基團的電荷狀態(tài)和長度等特征緊密相關(guān)，因此可利用電場力驅(qū)動單個分子通過納米孔引起的皮安級電流變化來表征單分子的信息。[1]  
不同性狀的待測物分子通過不同理化性質(zhì)的納米孔蛋白時，產(chǎn)生阻斷電流的程度、頻率及時間不同，通過對大量阻斷電流信號的統(tǒng)計分析，可在單分子水平獲取分子的尺寸、結(jié)構(gòu)及電荷等信息(圖3)。[2]  
將生物納米孔作為“天然傳感器”并用于分析生物、化學(xué)分子的技術(shù)始于20世紀(jì)90年代中期。1996年，Deamer和Branton教授等首次證實了單個單鏈DNA(ssDNA)分子和RNA分子可通過由金黃色葡萄球菌 α-溶血素( α-Hemolysin, α-HL)構(gòu)建的天然納米孔通道，并且能檢測到它們通過這種納米級孔道時所造成的電流改變。[3]
 
基于這一研究結(jié)果，Deamer、Branton和Church教授等進一步提出了根據(jù)不同種類堿基通過納米孔時產(chǎn)生的特征電流阻斷信號來推導(dǎo)出單鏈核酸的堿基序列信息，并最終實現(xiàn)對單分子核酸鏈的堿基序列測定(圖4)。該研究開創(chuàng)了利用生物納米孔高效分析生物、化學(xué)分子的新時代。目前生物納米孔分析技術(shù)已逐步發(fā)展成為重要的單分子分析手段，憑借其分析靈敏度高（超高的時間分辨率~10 μs和電流分辨率<0.1 pA）、快速、低成本及無需分子修飾標(biāo)記(如熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記)或表面固定等優(yōu)勢，使得其在生物和化學(xué)等諸多領(lǐng)域應(yīng)用前景廣泛。  
生物納米孔可以通過多種方式形成，孔徑范圍分布較大(圖5)。通過基因工程技術(shù)，可得到不同孔徑大小、縮頸高度的用于分析不同分子的納米孔蛋白。生物體中許多進程都會涉及到生物聚合鏈穿越嵌入生物膜上通道, 這些通道和生物大分子在空間結(jié)構(gòu)尺度上與納米技術(shù)相吻合, 因此生物納米孔技術(shù)的發(fā)展為核酸、蛋白質(zhì)等生物分子識別的研究提供了更多的可能性。利用構(gòu)建的各種不同孔徑和表面特性的納米孔蛋白，可對離子、DNA、RNA、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、藥物分子、聚合物大分子等各種物質(zhì)進行分析表征。  
一般情況下，生物納米孔的尺寸應(yīng)與分析物的尺寸相當(dāng)(圖6)，以便被分析物產(chǎn)生出可測量的高信噪比的電流振幅變化。經(jīng)基因工程定向改造或化學(xué)修飾得到的生物納米孔，可以進一步增強納米孔與被分析物之間的相互作用，提高其整體靈敏度和選擇特異性。[2] 例如，更大尺寸的生物納米孔，可允許折疊蛋白或結(jié)構(gòu)域等更大的分子進入，以便分析蛋白與其他蛋白、藥物或底物的相互作用�？茖W(xué)家甚至開發(fā)出了可用于癌癥生物標(biāo)記物檢測、藥物手性異構(gòu)體拆分等功能性納米孔蛋白。  
生物納米孔分析技術(shù)應(yīng)用與發(fā)展
生物納米孔分析技術(shù)最初是為了對離子和小分子進行監(jiān)測而開發(fā)的。最先得以突破性的應(yīng)用為核酸的測序領(lǐng)域。得益于其顯著的優(yōu)勢點：
納米孔能夠以相對較高的速率逐個連續(xù)捕獲單個分子，這使得納米孔能夠在合理的時間范圍內(nèi)在單分子水平上探索大量分子
納米孔將分析物的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)轉(zhuǎn)換為可測量的電流信號，極大地簡化了儀器設(shè)備的復(fù)雜程度
納米孔為構(gòu)建仿生系統(tǒng)提供了一個定義明確的支架，涉及生物分子相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，為解開復(fù)雜生物過程提供了可行的方法,使得生物納米孔具有超高的動態(tài)分辨率，足以分辨小如單個原子的檢測分析物，成為名副其實的單分子分析的多面手，應(yīng)用前景非常廣闊(圖7)
 
目前，生物納米孔分析技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)不限于：DNA/RNA測序和表觀遺傳修飾分析(堿基序列及堿基修飾識別)；并以極快的速度拓展到：蛋白質(zhì)/多肽分析(一級序列、高級構(gòu)型和構(gòu)象等)、多糖、聚合物、有機小分子(結(jié)構(gòu)、大小、構(gòu)型和構(gòu)象)，金屬離子檢測及納米粒子等的表征分析；還可用于分析監(jiān)測特定生化反應(yīng)的過程和作為相關(guān)生化反應(yīng)的載體和媒介；甚至是疾病診斷的生物標(biāo)志物的分析鑒定。[5,6,7,8]   
1、核酸堿基序列的測定
生物納米孔傳感器目前被大規(guī)模成功應(yīng)用的領(lǐng)域為基因測序。已有多款基于生物納米孔開發(fā)的測序儀成功地實現(xiàn)了商業(yè)化，并在基礎(chǔ)科研領(lǐng)域大放異彩，解決了很多科研難題。當(dāng)前基于生物納米孔的核酸測序技術(shù)主要有三個流派：納米孔直接鏈測序法、引入聚合酶和標(biāo)記修飾核苷酸的邊合成邊測序法以及外切酶測序法，這三種技術(shù)各有特點。
 
(1)納米孔直接鏈測序
其基本原理為核酸分子(DNA/RNA)經(jīng)接頭幫助到達納米孔附近，在解旋酶/馬達蛋白的解旋/控速下，單鏈通過生物納米孔的孔道；傳感器檢測到不同核苷酸通過所引起的電流變化的差異并將其轉(zhuǎn)換為電信號；再根據(jù)電信號變化的頻譜，應(yīng)用模型識別算法得到堿基類型從而達到測序的目的(圖8)。[9,10]
 
該方法具有測序速度快、堿基修飾可分析、文庫構(gòu)建簡單等特點。但由于納米孔的最窄縮頸部的長度可容納多個核苷酸，這種結(jié)構(gòu)使得核酸單鏈分子通過納米孔時產(chǎn)生的阻斷電流信號是由多個核苷酸的整體阻斷效應(yīng)造成的，而非單個核苷酸的阻斷效應(yīng)造成的，并且較難從整體阻斷電流信息中清晰地得出單個堿基的阻斷電流信息，特別是檢測單一堿基連續(xù)多次重復(fù)的均聚物時，容易漏讀和多讀。  
(2)引入聚合酶和標(biāo)記修飾核苷酸的邊合成邊測序法
著名的遺傳學(xué)家George Church教授和基因測序技術(shù)專家Jing yue Ju教授等基于生物納米孔傳感器開發(fā)出了一種新的DNA測序平臺，該平臺包含磷脂膜上由7個亞基形成了納米孔孔道，其中一個特定的亞基上通過肽鏈橋/小分子鏈結(jié)合了僅具有合成功能的DNA聚合酶，可以合成與待測模版鏈互補的DNA鏈。通過預(yù)先連接在模版鏈上的引物，聚合酶摻入互補的核苷酸(dNTP)，每一種核苷酸都攜帶了特定的標(biāo)記物(Tag)。當(dāng)聚合酶按照模板逐步合成時，標(biāo)記物依次被切割，在電場力和半封閉的空間通道引導(dǎo)的綜合作用下進入到納米孔中引起特征電流的阻斷信號，從而達到表征核酸序列的目的(圖9)。[11,12]
 
該方法具有測序準(zhǔn)確度高等特點。但由于引入了特種DNA聚合酶及堿基標(biāo)記物修飾的核苷酸，整個系統(tǒng)的復(fù)雜程度高，需要各個工作元器件精妙的配合才能夠?qū)崿F(xiàn)有效測序。  
(3)外切酶測序法
其基本原理為核酸單鏈在核酸外切酶的作用下，被依次剪切為單核苷酸，在電場力的作用下，待檢測單個核苷酸通過納米孔時引起的電流變化，根據(jù)不同種類堿基通過納米孔時產(chǎn)生的特征弱離子流信號，即可讀出每條單鏈DNA上的序列信息。由于單個核苷酸通過納米孔的速度極快，且造成的阻斷電流信號極小，單個核苷酸之間引起的電流阻斷的差異極其微弱，目前還無法有效地用于區(qū)分核苷酸的種類，阻礙了外切酶-納米孔測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。
 
2、核酸堿基修飾的測定
DNA的堿基修飾（包括5-mC、5-hmC、5-fC、5-caC、4-mC和6-mA等）在個體發(fā)育、衰老和癌癥的篩查和診斷中發(fā)揮了重要功能。這些修飾并不干擾Watson-Crick配對原則，但能調(diào)控基因的開關(guān)。與DNA類似，RNA也具有多種修飾(真核生物常見為6-mA)，并且這些修飾參與了mRNA的剪接和蛋白翻譯等各個方面。了解特定修飾在基因組或轉(zhuǎn)錄組上的精確定位是解析其生物學(xué)功能的關(guān)鍵。近年來利用高通量測序鑒定DNA/RNA修飾位點的技術(shù)極大地助力了表觀基因組學(xué)和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究。DNA甲基化檢測的方法有很多種，但大多離不開亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化是將序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║），而甲基化的胞嘧啶保持不變。然而，重亞硫酸鹽處理會導(dǎo)致DNA的降解，限制了在稀少珍貴樣品中的應(yīng)用。另外，由于占基因組95%的未甲基化C轉(zhuǎn)變成了T，降低了測序片段的匹配基因組的效率，也帶來了覆蓋度的偏好性。且該方法并不能區(qū)分5-mC和5-hmC，也無法識別其他類型的堿基修飾。反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增會導(dǎo)致RNA堿基的修飾信息丟失，因此無法通過二代測序平臺來直接分析鑒別RNA上的堿基修飾情況。必須依靠抗體免疫沉淀或化學(xué)修飾可以實現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄組RNA修飾圖譜繪制。但這些方法可檢測的修飾種類有限，且通常只針對一種特定的修飾，仍有大量 RNA 修飾無法被檢測或被定位。目前大量的研究顯示，基于生物納米孔分析計劃，可以高效地識別DNA和RNA上的多種類型的堿基修飾。
 
(1)DNA堿基修飾的識別
生物納米孔測序技術(shù)能夠檢測核酸分子自身的物理化學(xué)特性，與未被修飾的核苷酸相比，被修飾的相同核苷酸通過納米孔時對電流產(chǎn)生的電流阻斷信號會發(fā)生特異性的改變，因此基因組上的修飾信息能被電流阻斷信號表達。研究表明，帶有甲基化修飾的核苷酸和不帶修飾的相同核苷酸通過納米孔時會產(chǎn)生不同的電信號特征，因此通過深度學(xué)習(xí)模型捕獲甲基化修飾分子的特殊電信號模式可以發(fā)展出基于生物納米孔測序信號的DNA分子甲基化修飾檢測工具(圖10A)�？梢赃M行長片段的讀取，并且具有直接獲取DNA修飾(無需化學(xué)或抗體處理)，具有重要意義。[13,14]  
(2)RNA堿基修飾的識別
通過基于生物納米孔的技術(shù)，在不經(jīng)反轉(zhuǎn)錄、無需擴增的條件下即可直接讀取 RNA 上的所有堿基修飾信息，極大的提高了RNA堿基修飾識別的效率(圖10B)。Huanle等借助納米孔測序平臺對RNA進行直接測序，高精度地檢測出N6-甲基腺苷(m6A) RNA修飾，準(zhǔn)確率達90%。該結(jié)果通過直接RNA測序鑒定RNA修飾的概念驗證，并為將來探索其他RNA修飾提供借鑒，為研究RNA修飾在其天然RNA環(huán)境中的生物學(xué)作用開辟了新途徑。[15]
 
南京大學(xué)黃碩教授團構(gòu)建了一種高分辨的恥垢分枝桿菌膜蛋白A(MspA)納米孔，可以準(zhǔn)確識別所有的經(jīng)典核苷酸和它們的主要修飾，實現(xiàn)了高達7種常見修飾核苷酸的同時檢測，包括5-甲基胞苷(m5C)、N6 -甲基腺苷(m6A)、N7-甲基鳥苷(m7G)、N1-甲基腺苷(m1A)、肌苷(I)、假尿嘧啶(Ψ)和二氫尿嘧啶(D)。為直接檢測 RNA 上的修飾，該團隊利用核酸外切酶將天然 RNA 消化成單核苷酸，然后使用高分辨納米孔檢測和機器學(xué)習(xí)分析，獲得消化產(chǎn)物中核苷酸的組成和豐度，最終重構(gòu)出原始 RNA 的序列組成和修飾信息，為直接鑒定 RNA 中的表觀遺傳學(xué)修飾提供了快速方便的單分子分析方法(圖11)。[16]  
生物納米孔傳感器小結(jié)與展望
生物納米孔分析技術(shù)作為一種新穎的單分子分析手段，已廣泛應(yīng)用于單分子水平上DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物的分析和表征，且不斷拓寬新的應(yīng)用邊界。越來越多的科研及臨床工作者致力于將單分子納米孔分析技術(shù)應(yīng)用到基礎(chǔ)科學(xué)研究和疾病的臨床診斷中，并取得了很多優(yōu)異的成果。隨著生物納米孔檢測技術(shù)和平臺的不斷提升和完善，并與其它傳感技術(shù)交叉融合，必將極大地推動基礎(chǔ)科研和精準(zhǔn)醫(yī)療的快速發(fā)展。
 
但也能發(fā)現(xiàn)，生物納米孔技術(shù)在實際樣品檢測、數(shù)據(jù)處理和檢測裝置等方面還存在著一些不夠完美之處，這些問題都一定程度限制了生物納米孔分析技術(shù)從科學(xué)研究到實際應(yīng)用的快速轉(zhuǎn)化和推廣。例如：
生物納米孔自身的靈敏度和選擇性仍有待進一步提高，需通過基因工程技術(shù)不斷定相優(yōu)化納米孔自身的特性。
生物納米孔分析技術(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量龐大、信號形態(tài)復(fù)雜、處理過程繁瑣、耗時等，需要不斷提升信號分析的算法和算力的綜合性能，才能準(zhǔn)確解讀這些數(shù)據(jù)信息。
高時間分辨、高電流分辨的生物納米孔匹配的信號采集和處理器發(fā)展較慢，納米孔生物傳感分析技術(shù)所能達到的時間分辨率、電流分辨不但與生物納米孔自身的特性有關(guān)，也與其匹配的信號采集和處理器的性能直接相關(guān)，需要進一步提升這些傳感器的性能，才能整體提升生物納米孔傳感器的綜合性能。
 
現(xiàn)階段，單分子基因測序是生物納米孔傳感領(lǐng)域內(nèi)最重要的應(yīng)用，隨著納米孔測序技術(shù)產(chǎn)業(yè)化逐步展開和升級，人們對超高通量納米孔測序（100萬個孔道及以上）的需求愈發(fā)迫切，因此亟待發(fā)展一種新型的納米孔檢測模式，在降低檢測成本的同時能夠突破現(xiàn)有檢測通量的局限。
 
參考文獻
[1]. Single molecule analysis by biological nanopore sensors. Analyst. 2014 Aug 21;139(16):3826-35.
[2]. Biological nanopores for single-molecule sensing. iScience. 2022 Mar 23;25(4):104145.
[3]. Characterization of individual polynucleotide molecules using a membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):13770-3.
[4]. Nanopore-based technologies beyond DNA sequencing. Nat Nanotechnol. 2022 Nov;17(11):1136-1146.
[5]. Progress in Biological Nanopore-based Analysis Technology[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry,2017. 34(8): 855-867.
[6]. Nanopore-Based Confined Spaces for Single-Molecular Analysis. Chem Asian J. 2019 Feb 1;14(3):389-397.
[7]. Nanopore-based technologies beyond DNA sequencing. Nat Nanotechnol. 2022 Nov;17(11):1136-1146.
[8]. Application of Nanopore Sensors for Biomolecular Interactions and Drug Discovery. Chem Asian J. 2022 Oct 4;17(19): e202200679.
[9]. Reading DNA at single-nucleotide resolution with a mutant MspA nanopore and phi29 DNA polymerase. Nat Biotechnol. 2012 Mar 25;30(4):349-53.
[10]. Automated forward and reverse ratcheting of DNA in a nanopore at 5-Å precision. Nat Biotechnol. 2012 Feb 14;30(4):344-8.
[11]. Design and characterization of a nanopore-coupled polymerase for single-molecule DNA sequencing by synthesis on an electrode array. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 1;113(44): E6749-E6756.
[12]. Real-time single-molecule electronic DNA sequencing by synthesis using polymer-tagged nucleotides on a nanopore array. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 May 10;113(19):5233-8.
[13]. Nanopore sensors for nucleic acid analysis. Nat Nanotechnol. 2011 Sep 18;6(10):615-24.
[14]. Detecting DNA cytosine methylation using nanopore sequencing. Nat Methods . 2017 Apr;14(4):407-410.
[15]. Accurate detection of m6A RNA modifications in native RNA sequences. Nat Commun. 2019 Sep 9;10(1):4079.
[16]. Identification of nucleoside monophosphates and their epigenetic modifications using an engineered nanopore. Nat Nanotechnol. 2022 Sep;17(9):976-983.