項目文章 :單細胞測序揭示SUMO1調(diào)控心肌梗死后的心臟修復機制

2022年11月27日，天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院研究團隊利用新格元單細胞測序技術揭示了SUMO1基于細胞異質(zhì)性調(diào)控心肌梗死后的心臟修復機制。該研究成果即將發(fā)表在《Journal of Pharmaceutical Analysis》期刊上。該論文第一署名單位為天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，劉志浩為第一作者，樊官偉和邊希云教授為共同通訊作者。
 
研究背景
SUMO化修飾是一種動態(tài)的翻譯后修飾，可維持心臟功能，并可保護心臟壓力過載的肥厚反應。然而，心肌梗死(MI)后SUMO化修飾的功能以及心臟細胞對SUMO1缺陷反應的分子機制尚未確定。在本研究中，作者構建了SUMO1-/-小鼠模型，通過單細胞核RNA(snRNA-seq)測序揭示了SUMO1在調(diào)節(jié)心臟細胞中的不同作用。
   
研究結果
1.SUMO1參與MI后的病理過程
為了確定SUMO1是否與MI后的修復反應有關，作者采用免疫組化檢測了MI后小鼠心臟切片中SUMO1的水平，MI后7天，梗死區(qū)SUMO1水平明顯升高(圖1A)，提示SUMO1參與MI后心臟病理修復過程。然而邊界區(qū)的SUMO1水平明顯降低(圖1B)。
為了進一步探索SUMO1對MI后心功能的影響，在MI后7天，對SUMO1-/-小鼠和同批次WT小鼠進行了檢測。MI后，與WT小鼠相比，SUMO1-/-小鼠在射血分數(shù)(EF)和縮短分數(shù)(FS)方面明顯表現(xiàn)出更差的心功能(圖1C-E)。染色結果也顯示， SUMO1-/-小鼠梗死面積更大，心室不良反應更嚴重(圖1F和G)。這些結果表明，心臟SUMO1缺失加重了MI誘導的不良心臟重塑和收縮功能障礙。
2.snRNA-seq鑒定四種主要心臟細胞群 
MI的病理過程涉及多種細胞類型。作者利用snRNA-seq在假手術或MI后第7天鑒定WT和SUMO1-/-小鼠心臟的細胞群(圖2A)。經(jīng)過篩選和質(zhì)控，共保留103,806個細胞，根據(jù)marker基因分為心肌細胞(CMs)、內(nèi)皮細胞(ECs)、成纖維細胞(FBs)和單核吞噬細胞(MPs)四種細胞類型 (圖2B-E)。這四種細胞的豐度在MI后發(fā)生了改變(圖2F)。例如，MI后CMs明顯丟失，且SUMO1-/-小鼠丟失比例高于WT小鼠，提示SUMO1缺失導致缺血缺氧損傷時CM代償能力下降。這些結果表明，SUMO1對MI后不同類型的心臟細胞具有不同的調(diào)節(jié)作用。
3.SUMO1缺失導致MI后Nppa+Nppb+Ankrd1+CM簇比例上升
CMs是決定MI后心臟命運的主要細胞類型，作者將來自所有樣本的52,611個CM聚類為6個不同的CM亞群 (圖3A)。CM-3簇特異性表達多種應激相關基因(Nppa, Nppb, Ankrd1)，這些基因是心臟病預后不良的標志，CM-3簇比例的增加可能表明損傷加重 (圖3D和E)。此外，SUMO1-/-小鼠MI后心房鈉尿肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)mRNA水平均高于WT小鼠(圖3F)。ANP和BNP水平與局部壁面應力呈正相關，會導致更大的梗死面積。通過免疫熒光染色，作者發(fā)現(xiàn)SUMO1-/-小鼠MI后邊界區(qū)域Ankrd1的表達高于WT小鼠(圖3G)，提示SUMO1缺失增加了MI后CM-3簇的比例。此外，MI引發(fā)了CM-4簇比例的增加，但在SUMO1-/-小鼠中卻相反。CM-4簇主要表達干擾素相關基因，可能參與心臟的免疫監(jiān)測，而SUMO1缺失可能損害這種作用。
TF活性分析顯示，CM-3簇顯示出應激相關TF的結合活性增加，如AP-1復合物中的Jun亞基(JunB和JunD)和Fos亞基(Fosl1和Fosl2)(圖3H)。JunD是CM肥大的負調(diào)控因子，在肥大刺激下降低ANP和BNP的表達。作者通過免疫共沉淀檢測MI后JunD與SUMO1的結合豐度。MI后，SUMO1的磷酸化水平和JunD的表達水平都降低了。與WT小鼠相比，SUMO1的缺失導致MI后JunD的表達進一步降低(圖3I)。SUMO1與JunD結合的減少導致JunD穩(wěn)定性降低，從而增加了MI后Nppa/Nppb的轉(zhuǎn)錄。這些結果表明，SUMO1主要通過調(diào)控邊界區(qū)CM-3簇參與心肌損傷。敲除SUMO1基因后，CM-3簇比例增加，心肌損傷相關基因表達水平增加，JunD參與了這一過程。
4.SUMO1基因的缺失抑制了MI后增生性FB簇向膠原分泌FB簇的轉(zhuǎn)化
為了探索FB亞群在MI后心臟重塑中的作用，作者將FBs細分為8個簇(FB1-8)，MI后，F(xiàn)B亞群大幅增殖 (圖4B)。作者使用CytoTrace分析FBs的分化軌跡，結果顯示，F(xiàn)B-2和FB-5簇(Postn、Col1a1和Col1a2低表達)是初始狀態(tài)FBs亞群， FB-3和FB-6簇(Col1a1, Col1a2和Col3a1高表達)是終末期FBs。與WT小鼠相比，MI后SUMO1-/-小鼠的FB-3和FB-6簇的比例有所降低。然而，F(xiàn)B-4簇的比例顯著增加，F(xiàn)B-4簇處于分化中間狀態(tài)，高表達增殖相關基因，表明其處于增殖狀態(tài)。使用Top2a和III型膠原進行免疫熒光染色顯示，與WT小鼠相比，SUMO1缺失導致MI后梗死區(qū)FB大量增殖，但膠原分泌減少(圖4G)。I型和III型膠原免疫組化染色顯示，SUMO1缺失減少了MI后膠原分泌。作者發(fā)現(xiàn)SUMO1缺失引發(fā)梗死區(qū)部分破裂，提示修復能力不足(圖4H)。這些發(fā)現(xiàn)表明，多個FB亞群參與了MI后修復反應，SUMO1缺失抑制了FBs從增殖狀態(tài)向膠原分泌狀態(tài)的分化。
5.SUMO1缺失促進MI后具有血管再生能力的EC亞群增殖
心肌損傷后梗死部位新生血管網(wǎng)絡的重建和恢復對改善MI的預后至關重要。MI后的血管穩(wěn)態(tài)和新生血管是由ECs調(diào)節(jié)的。作者將ECs分為9個不同的EC亞群 (圖5A)。MI后EC-2、EC-5、EC-8和EC-9比例增加，而EC-1和EC-3比例相對Sham組減少，說明MI后EC亞群參與不同功能(圖5B)。差異基因分析顯示，EC-2簇高表達冠狀動脈EC標記物Fabp4以及組織修復和血管生成標記物Sparcl1，表明EC-2簇可能在心肌損傷的血管重建過程中充當冠狀動脈ECs。EC-5簇主要表達激活ECs亞群標記物Selp和Rasa4。EC-7簇表達Sema3g，參與血管發(fā)育、血管生成和心肌缺血缺氧時新血管的重塑。利用Monocle擬時序分析EC亞群的發(fā)育軌跡，作者發(fā)現(xiàn)MI誘導EC分化，而SUMO1缺失進一步促進EC分化，因為SUMO1-/-組聚集在終端狀態(tài)(圖5D和E)。具體來看，SUMO1缺失增加了MI后EC-2、EC-5、EC-7和EC-9簇的比例，這些亞群主要負責EC激活、冠狀動脈/小動脈血管重建和再生，有利于MI后的心功能恢復(圖5G)。
為了進一步探討SUMO1缺失對MI后ECs的影響，作者用Pecam1和Ki67進行免疫熒光染色。結果顯示，SUMO1缺失促進了Ki67+ ECs在MI后梗死區(qū)的分布。此外，Pecam1和α-SMA的免疫熒光結果顯示，SUMO1缺失導致梗死區(qū)大量小血管形成(圖5H)。這些結果表明，SUMO1缺失有利于EC增殖，從而促進梗死區(qū)新生血管的形成。
6.SUMO1通過抑制VEGFA信號來阻止新生血管形成
為了進一步研究心臟中不同細胞類型之間的通信網(wǎng)絡，作者使用CellPhoneDB進行了全面和系統(tǒng)的分析(圖6A)。EC2、EC-5和EC-9簇作為負責EC激活、冠狀動脈/小動脈血管生成和重建的EC亞群，受到CMs分泌的VEGFA的調(diào)控(圖6C)。為了研究SUMO1缺失是否促進VEGFA介導的EC增殖，作者將SUMO1沉默(siSUMO1)和SUMO1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈EC(HUVECs)(圖6D和E)。在體外實驗中，SUMO1的沉默顯著增強了VEGFA誘導的HUVECs的增殖和遷移能力(圖6F和G)。為了進一步確定SUMO1是否介導VEGFA的血管生成信號，作者進行了基質(zhì)管形成實驗。在HUVECs中，SUMO1的沉默顯著促進了VEGFA誘導的EC小管形成，而過表達SUMO1則導致了小管和分支數(shù)量的減少(圖6H和I)。此外，SUMO1基因沉默增加了VEGFA介導的HUVECs G2/M比例(圖6J和K)。這些發(fā)現(xiàn)表明，VEGFA促進EC增殖的作用被SUMO1抑制，這不利于MI后的血管新生和血管重建。
7.CM特異性SUMO1基因治療減弱MI后的病理反應
為了確定CM特異性SUMO1基因治療是否是一種有效的預防性治療策略，作者在8周齡小鼠尾靜脈注射腺相關病毒(AAV)，21天后進行MI或假手術(圖7A)。與AAV-CTnT-EGFP對照組相比，AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導小鼠對MI誘導的異常心功能更有抵抗力，心功能障礙顯著減少，心肌損傷程度也較低(圖7B和C)。與對照組相比，CM特異性SUMO1過表達顯著降低MI后ANP和BNP mRNA水平(圖7E)。蘇木精、伊紅和Masson染色顯示，與對照組相比，AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導小鼠MI后梗死面積更小，心室重塑改善，纖維化水平顯著降低(圖7F和G)，且AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導小鼠的邊界區(qū)域CM面積顯著減小(圖7H)。免疫熒光結果顯示，AAV-CTnT-SUMO1轉(zhuǎn)導小鼠在梗死區(qū)周圍表現(xiàn)出更少的Ankrd1+CMs和更高的JunD+CMs分布(圖7I)。這些結果表明，在病理條件下SUMO1在CMs中過表達可以緩解心臟重構，增強心臟功能。  
結論
該研究確定了SUMO1在心肌損傷后心臟修復過程中的作用，并描述了SUMO1在MI后不同類型的心臟細胞(包括CMs、FBs和ECs)中的功能。在高分辨率下確定了SUMO1的缺失觸發(fā)了不同類型細胞的轉(zhuǎn)錄譜，并表明SUMO1通過不同的信號通路參與MI后的心臟重塑。該數(shù)據(jù)集也為進一步研究SUMO1對MI后不同心臟細胞亞群的調(diào)節(jié)作用提供了寶貴的資源。  
參考文獻
Z. Liu, X. Liu, L. Liu, et al. SUMO1 regulates post-infarct cardiac repair based on cellular heterogeneity, Journal of Pharmaceutical Analysis, https://doi.org/10.1016/j.jpha.2022.11.010.