實時活細胞成像技術在臨床醫(yī)學中的應用
先天性心臟病等心臟大血管疾病患者需要外科手術治療。心臟外科手術需要在心臟停跳狀態(tài)下進行，而在心臟停跳過程中，不可避免地會出現(xiàn)不同程度的心肌損傷。應用心臟停搏液不僅可以在手術過程中誘導心臟快速停跳、保持心臟停跳期間的心臟靜止狀態(tài)、縮短心臟停跳時間，更大限度減少心肌損傷、維護正常的心臟功能，其優(yōu)劣還可以直接影響手術效果。目前，許多臨床試驗比較了不同的心臟停搏液和心臟保護方案，但鮮有文章對體外條件培養(yǎng)的細胞進行研究。
本研究采用新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X， 對作為體外模型的大鼠心肌細胞進行長時間成像和分析，評估了St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）的可能用途以及細胞效應，并且預估了心臟細胞的安全暴露時間，這個結(jié)果對心臟保護和心臟外科手術中選擇合適的方案提供了十分有意義的參考價值。
實驗方法
將大鼠心肌細胞H9C2與冷停搏液共孵育24小時。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖細胞核抗原表達（PCNA）在置于細胞培養(yǎng)箱中的活細胞成像平臺CellCyte X上測定細胞的活力、匯合性、細胞大小、巰基水平。另外通過超微結(jié)構(gòu)（TEM）研究和全斷層3D成像，觀察對細胞形態(tài)的影響。
實驗結(jié)果
1.細胞活力、匯合性和體積
ST2C的效果通過對H9C2細胞生存能力、匯合性和體積的分析得到了驗證。
CellCyte X成像研究表明，短時間的暴露不會影響細胞的生存和匯合（圖1）。在2h時細胞的活力是對照未處理細胞的50%以上（圖1a）。匯流分析表明4h為終止時間，此后匯流開始下降（圖1b）。細胞體積分析表明暴露于心臟停搏液的細胞體積增加，腫脹，并在24小時內(nèi)保持不變（圖1c）。同時，我們觀察到了初始細胞體積的差異，這可能與實驗程序方案有關，實驗組細胞在測量前暴露于停搏液ST2C 10-15分鐘，短暫的預孵育時間可能會導致細胞腫脹并保持24小時，我們觀察到正常的細胞體積在同一時間內(nèi)保持不變。
2.心臟停搏液對心肌細胞形態(tài)的影響
超微結(jié)構(gòu)（TEM）將暴露于ST2C后的細胞可視化（圖2）。用ST2C孵育1h后，與對照未處理細胞相比，心肌細胞線粒體有輕微病理變化（圖2b）。2h時線粒體的嵴輕微腫脹，這似乎與細胞體積結(jié)果相符，但細胞核顯示出正常的、未受影響的大小和形狀。此外我們觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹（圖2c）。與ST2C孵育24小時后，形成空泡和髓磷脂體，其中一些含有電子致密物質(zhì)（圖2d），與未暴露的對照細胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體顯示出正常的形態(tài)。這些結(jié)果表明ST2C對H9C2細胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有時間依賴性。
圖3展示了H9C2細胞的三維視圖，可見無擾動形態(tài)。和TEM研究類似，只有更長的孵育時間才導致空泡化增加。接著，在24小時后測量巰基的水平，如圖4所示，暴露的時間越長，對H9C2細胞越有害。觀察到ST2C顯著增加了SH組的水平，這可能與體積增加和細胞腫脹有關。然后通過免疫染色反應來可視化，表1和表2顯示暴露于ST2C 24h后增殖標記物PCNA和Ki67表達增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后發(fā)生染色反應的細胞數(shù)量增加。在Ki67的情況下，我們可以在所有情況下幾乎100%的細胞中檢測到免疫染色反應，其中24h時免疫染色反應最強烈。
圖2.H9C2細胞的透射電鏡圖 （a）未處理對照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心臟麻痹。C： 細胞質(zhì)M：線粒體，N：細胞核，ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，GA高爾基體；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶體。
圖3. H9C2細胞全息層析顯微成像 （a)未經(jīng)處理對照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI標記物染色的藍色細胞核
圖4.用ST2C孵育24小時后，大鼠成肌細胞中作為蛋白質(zhì)損傷標志物的巰基（SH-）水平。數(shù)據(jù)以µM/L蛋白質(zhì)表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.與ST2C孵育后H9C2細胞中PCNA表達的分析（*p<0.05）
表2.與ST2C孵育后H9C2細胞中Ki67表達的分析（*p<0.05）
實驗結(jié)論
使用活細胞成像平臺CellCyte X 對體外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）可以通過增加蛋白二硫化物和增殖標記物（PCNA和Ki67）來保護和維持H9C2大鼠心肌細胞，且不會對形態(tài)學造成顯著的形態(tài)學變化。但是對于敏感的新生兒成肌細胞，保護時間限制在4小時內(nèi)。本次實驗結(jié)果表明，St.ThomasⅡ型心臟停搏液對保護心肌細胞有一定的作用，并且是一種經(jīng)濟且簡單的解決方案。
CellCyte X 在臨床醫(yī)學領域中的成像優(yōu)勢
新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X可以為臨床醫(yī)學提供自動化的、連續(xù)的動態(tài)細胞生長分析:
一、提高細胞活率：可以內(nèi)置在任何廠牌的培養(yǎng)箱中，降低了實驗過程中對細胞的干擾
二、實時收集與分析數(shù)據(jù)：在整個實驗過程中，可實時對數(shù)據(jù)進行收集與處理
三、通量高：可同時放置6塊微孔板，更大限度滿足您對實驗通量的需求
四、開放式設計：便于對細胞生長環(huán)境的維持，提高了實驗環(huán)境的可控性與更佳的細胞狀態(tài)
五、軟件平臺簡潔直觀：直觀的成像與分析界面設計，方便使用者學習與操作，人人都可輕易上手
六、三通道熒光：增強的輪廓成像模式，除了明場還有紅、藍、綠3色熒光通道，讓實驗可進行多重復用
七、數(shù)據(jù)分析功能強大：每次實驗可根據(jù)需求采集存儲數(shù)千張五百萬像素的高清圖像
八、設計緊湊：儀器結(jié)構(gòu)設計緊湊，易于安裝與維護，大幅降低了維護成本
如果您想了解更多，歡迎聯(lián)系我們。
本研究采用新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X， 對作為體外模型的大鼠心肌細胞進行長時間成像和分析，評估了St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）的可能用途以及細胞效應，并且預估了心臟細胞的安全暴露時間，這個結(jié)果對心臟保護和心臟外科手術中選擇合適的方案提供了十分有意義的參考價值。
實驗方法
將大鼠心肌細胞H9C2與冷停搏液共孵育24小時。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖細胞核抗原表達（PCNA）在置于細胞培養(yǎng)箱中的活細胞成像平臺CellCyte X上測定細胞的活力、匯合性、細胞大小、巰基水平。另外通過超微結(jié)構(gòu)（TEM）研究和全斷層3D成像，觀察對細胞形態(tài)的影響。
實驗結(jié)果
1.細胞活力、匯合性和體積
ST2C的效果通過對H9C2細胞生存能力、匯合性和體積的分析得到了驗證。
CellCyte X成像研究表明，短時間的暴露不會影響細胞的生存和匯合（圖1）。在2h時細胞的活力是對照未處理細胞的50%以上（圖1a）。匯流分析表明4h為終止時間，此后匯流開始下降（圖1b）。細胞體積分析表明暴露于心臟停搏液的細胞體積增加，腫脹，并在24小時內(nèi)保持不變（圖1c）。同時，我們觀察到了初始細胞體積的差異，這可能與實驗程序方案有關，實驗組細胞在測量前暴露于停搏液ST2C 10-15分鐘，短暫的預孵育時間可能會導致細胞腫脹并保持24小時，我們觀察到正常的細胞體積在同一時間內(nèi)保持不變。
圖1.ST2C對H9C2細胞的影響
- MTT法測定存活率；（b）細胞匯合性；（c）暴露24h后的細胞體積；可行性結(jié)果表示為平均值±SD。單向方差分析：*p<0.05，**p>0.005。
2.心臟停搏液對心肌細胞形態(tài)的影響
超微結(jié)構(gòu)（TEM）將暴露于ST2C后的細胞可視化（圖2）。用ST2C孵育1h后，與對照未處理細胞相比，心肌細胞線粒體有輕微病理變化（圖2b）。2h時線粒體的嵴輕微腫脹，這似乎與細胞體積結(jié)果相符，但細胞核顯示出正常的、未受影響的大小和形狀。此外我們觀察到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕微腫脹（圖2c）。與ST2C孵育24小時后，形成空泡和髓磷脂體，其中一些含有電子致密物質(zhì)（圖2d），與未暴露的對照細胞相比，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體顯示出正常的形態(tài)。這些結(jié)果表明ST2C對H9C2細胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有時間依賴性。
圖3展示了H9C2細胞的三維視圖，可見無擾動形態(tài)。和TEM研究類似，只有更長的孵育時間才導致空泡化增加。接著，在24小時后測量巰基的水平，如圖4所示，暴露的時間越長，對H9C2細胞越有害。觀察到ST2C顯著增加了SH組的水平，這可能與體積增加和細胞腫脹有關。然后通過免疫染色反應來可視化，表1和表2顯示暴露于ST2C 24h后增殖標記物PCNA和Ki67表達增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后發(fā)生染色反應的細胞數(shù)量增加。在Ki67的情況下，我們可以在所有情況下幾乎100%的細胞中檢測到免疫染色反應，其中24h時免疫染色反應最強烈。
圖2.H9C2細胞的透射電鏡圖 （a）未處理對照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心臟麻痹。C： 細胞質(zhì)M：線粒體，N：細胞核，ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，GA高爾基體；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶體。
圖3. H9C2細胞全息層析顯微成像 （a)未經(jīng)處理對照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI標記物染色的藍色細胞核
圖4.用ST2C孵育24小時后，大鼠成肌細胞中作為蛋白質(zhì)損傷標志物的巰基（SH-）水平。數(shù)據(jù)以µM/L蛋白質(zhì)表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.與ST2C孵育后H9C2細胞中PCNA表達的分析（*p<0.05）
表2.與ST2C孵育后H9C2細胞中Ki67表達的分析（*p<0.05）
實驗結(jié)論
使用活細胞成像平臺CellCyte X 對體外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心臟停搏液（ST2C）可以通過增加蛋白二硫化物和增殖標記物（PCNA和Ki67）來保護和維持H9C2大鼠心肌細胞，且不會對形態(tài)學造成顯著的形態(tài)學變化。但是對于敏感的新生兒成肌細胞，保護時間限制在4小時內(nèi)。本次實驗結(jié)果表明，St.ThomasⅡ型心臟停搏液對保護心肌細胞有一定的作用，并且是一種經(jīng)濟且簡單的解決方案。
CellCyte X 在臨床醫(yī)學領域中的成像優(yōu)勢
圖5. CellCyte X儀器
新一代活細胞實時動態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)CellCyte X可以為臨床醫(yī)學提供自動化的、連續(xù)的動態(tài)細胞生長分析:
一、提高細胞活率：可以內(nèi)置在任何廠牌的培養(yǎng)箱中，降低了實驗過程中對細胞的干擾
二、實時收集與分析數(shù)據(jù)：在整個實驗過程中，可實時對數(shù)據(jù)進行收集與處理
三、通量高：可同時放置6塊微孔板，更大限度滿足您對實驗通量的需求
四、開放式設計：便于對細胞生長環(huán)境的維持，提高了實驗環(huán)境的可控性與更佳的細胞狀態(tài)
五、軟件平臺簡潔直觀：直觀的成像與分析界面設計，方便使用者學習與操作，人人都可輕易上手
六、三通道熒光：增強的輪廓成像模式，除了明場還有紅、藍、綠3色熒光通道，讓實驗可進行多重復用
七、數(shù)據(jù)分析功能強大：每次實驗可根據(jù)需求采集存儲數(shù)千張五百萬像素的高清圖像
八、設計緊湊：儀器結(jié)構(gòu)設計緊湊，易于安裝與維護，大幅降低了維護成本
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