柯薩奇病毒A16抗體中和的分子機(jī)制

柯薩奇病毒A16(CVA16)是小核糖核酸病毒科腸道病毒屬的成員，是嬰幼兒中流行的手足口病 (HFMD)的主要病原體之一。CVA16感染可能導(dǎo)致自限性疾病以及嚴(yán)重的臨床結(jié)果，例如腦炎、心肌炎、肺炎，甚至死亡。此外，CVA16經(jīng)常與其他引起手足口病的病原體共同傳播，例如人類(lèi)腸道病毒A71(EV71)、柯薩奇病毒A6(CVA6)和柯薩奇病毒A10(CVA10)，導(dǎo)致共同感染和病毒基因重組，這使得防控手足口病更具挑戰(zhàn)性。
 
01 研究初衷
2022年12月21日，中國(guó)科學(xué)院分子病毒學(xué)與免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室Chao Zhang團(tuán)隊(duì)在Nature上發(fā)表一篇名為《Molecular mechanism of antibody neutralization of coxsackievirus A16》的文章，他們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的初衷是研究?jī)煞N CVA16 特異性中和單克隆抗體 (MAb) 9B5 和 8C4 的功能和工作機(jī)制，從而改善目前沒(méi)有可用于柯薩奇病毒CVA16 的疫苗或抗病毒劑的困境。

02針對(duì) CVA16 的中和 MAb 的鑒定
 為了制備CVA16 特異性中和MAb，用滅活CVA16（菌株SZ05）免疫小鼠，從中產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，獲得了三個(gè)具有中和活性的穩(wěn)定雜交瘤單克�。�8C4、9B5和9G1）。分別測(cè)試了同種型和中和作用、細(xì)胞活力、病毒顆粒的結(jié)合動(dòng)力學(xué)等參數(shù)。
  圖1：抗 CVA16 MAb 的中和、結(jié)合親和力和相互競(jìng)爭(zhēng)
 
根據(jù)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，三個(gè)MAbs可以被分為兩個(gè)非競(jìng)爭(zhēng)性的抗體組：第1組由9B5和9G1組成，第2組由8C4單獨(dú)構(gòu)成。MAb 9B5比第1組中的9G1和第2組中的8C4具有更強(qiáng)的中和作用，被選為兩個(gè)抗體組的代表進(jìn)行后續(xù)深入分析。
 
03 8C4和9B5的預(yù)防和治療功效
給幾組剛出生1天的 ICR 小鼠注射 PBS、10 mg/kg 的抗 CVA16 單克隆抗體 8C4 或 9B5、8C4 和 9B5 的組合（每種抗體 10 mg/kg），或10 mg/kg 的 IgG 對(duì)照抗體 2H2。二十四小時(shí)后，小鼠受到 CVA16/MAV 病毒攻擊，每天記錄小鼠的生命狀態(tài)和臨床評(píng)分。 圖2：抗 CVA16 MAb 的體內(nèi)保護(hù)功效
 
除了一只小鼠以外，所有用 8C4、9B5 或 8C4 + 9B5 組合處理的小鼠都表現(xiàn)出健康的生命體征。這些數(shù)據(jù)證明了 8C4、9B5 和 8C4 + 9B5 組合的起到有效的體內(nèi)預(yù)防功效。
 
04 MAb 8C4 和 9B5 的中和機(jī)制
 進(jìn)行MAb 在哪個(gè)步驟發(fā)揮抗病毒作用確定。簡(jiǎn)而言之，培養(yǎng)的細(xì)胞要么與單個(gè) MAb 預(yù)混合的 CVA16（附著前）接種，要么在病毒附著后（ 4 °C）的不同時(shí)間點(diǎn)用 MAb 處理細(xì)胞（附著后）。然后，在感染后 6 小時(shí)分析細(xì)胞的相對(duì)病毒 RNA 水平。 圖3：MAb 的中和機(jī)制

結(jié)果表明，附著后 0.5 小時(shí)是 8C4 進(jìn)行中和作用的關(guān)鍵添加時(shí)間點(diǎn)，因此 8C4 可能會(huì)在病毒進(jìn)入附著后的早期階段進(jìn)行阻斷，9B5主要在感染的附著前階段發(fā)揮中和作用。

05 8C4/9B5 混合物可防止病毒逃逸
  CVA16-9B5 C1 和 CVA16-8C4 C1 的冷凍電鏡圖疊加顯示 8C4 和 9B5 識(shí)別不同的、不重疊的表位，因此可能同時(shí)結(jié)合相同的表位CVA16 病毒衣殼。因此，這兩種 MAb 可以用作非競(jìng)爭(zhēng)抗體對(duì)。通過(guò)以 1:1 的比例混合兩種抗體來(lái)制備 8C4/9B5 混合物，并分析針對(duì) CVA16/SZ05 的中和作用。
 
圖4：MAb 8C4 和 9B5 的組合可防止 CVA16 病毒逃逸突變
8C4/9B5 cocktail 的中和活性略強(qiáng)于單獨(dú)的 9B5，表明 8C4 與 9B5 聯(lián)合使用時(shí)具有相容性。
 
綜上所述，我們的研究清楚地定義了針對(duì)衣殼五重和三重頂點(diǎn)的兩組 CVA16 特異性中和 MAb 的功能和工作機(jī)制，并證明了 9B5/8C4 抗體混合物顯示出更高的中和效力，并獲得了一種獨(dú)特的能力來(lái)防止病毒逃逸，這在單個(gè)抗體中是可見(jiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)抗 CVA16 疫苗和療法的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)具有重要意義。