mRNA技術(shù)在傳染病疫苗研發(fā)中的應(yīng)用及進(jìn)展

早在30多年前，科學(xué)家們就構(gòu)思出基于 mRNA 的核酸疫苗，能夠開(kāi)發(fā)出安全和多功能的核酸疫苗。如今隨著mRNA技術(shù)的不斷發(fā)展，這一愿望終于照進(jìn)現(xiàn)實(shí)，新冠mRNA疫苗率先開(kāi)發(fā)成功并投入生產(chǎn)，推動(dòng)了mRNA疫苗在他傳染病領(lǐng)域、癌癥、罕見(jiàn)病等領(lǐng)域的研發(fā)進(jìn)展。

2021年8月25日，Nature Reviews Drug Discovery發(fā)表了一篇深度綜述，詳細(xì)介紹了mRNA疫苗的技術(shù)基礎(chǔ)，以及傳染病mRNA疫苗開(kāi)發(fā)的最近進(jìn)展和關(guān)鍵問(wèn)題。

圖1
 

在這篇綜述中，作者描述了 mRNA 疫苗的技術(shù)基礎(chǔ)，包括 mRNA 設(shè)計(jì)和合成，以及遞送技術(shù)并強(qiáng)調(diào)了正在進(jìn)行的平臺(tái)優(yōu)化工作的主要焦點(diǎn)。之后概述了針對(duì)流感、寨卡病毒和呼吸道合胞病毒 (RSV) 等多種傳染病的 mRNA 疫苗的開(kāi)發(fā)進(jìn)展，并討論了該平臺(tái)未來(lái)面臨的關(guān)鍵問(wèn)題，包括安全性、反應(yīng)持續(xù)時(shí)間、在特定人群中的應(yīng)用和實(shí)現(xiàn)全球疫苗可及性。
 

mRNA的設(shè)計(jì)和合成原理

mRNA疫苗的主要包含人工合成的mRNA分子，它們指導(dǎo)抗原的產(chǎn)生，從而激發(fā)免疫反應(yīng)。mRNA的結(jié)構(gòu)主要包括5個(gè)部分，從5’端開(kāi)始，分別是5’cap，5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)（UTR），編碼抗原的開(kāi)放閱讀框，3’UTR和poly A尾巴。每個(gè)部分對(duì)于mRNA疫苗的正常工作都至關(guān)重要。

5’端帽的作用之一是防止mRNA被細(xì)胞中識(shí)別病毒RNA的傳感器發(fā)現(xiàn)，從而預(yù)防意外的免疫反應(yīng)。它還在空間上保護(hù)mRNA免受核酸外切酶的降解。3’ poly A尾的長(zhǎng)度間接調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯和半衰期。5’和3’UTR調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)譯、半衰期和細(xì)胞內(nèi)定位。對(duì)UTR的工程化設(shè)計(jì)可以改變mRNA的細(xì)胞定位，或者降低mRNA的降解。

圖2 mRNA結(jié)構(gòu)的5個(gè)部分[1]

編碼抗原的開(kāi)放閱讀框是最重要的一部分。這一部分的改良包括對(duì)mRNA密碼子的優(yōu)化，將不常用的密碼子轉(zhuǎn)換為編碼同一氨基酸的常用密碼子可以提高轉(zhuǎn)譯水平。例如，CureVac公司的新冠疫苗CVnCoV就使用了密碼子優(yōu)化。

提高翻譯效率的另一個(gè)措施是引入修飾核苷，例如假尿嘧啶，N1-甲基假尿嘧啶等核苷。使用修飾過(guò)的核苷能夠防止模式識(shí)別受體的識(shí)別，降低免疫原性，增加翻譯。Moderna和輝瑞/BioNTech的mRNA新冠疫苗都使用了修飾過(guò)的核苷。

除了改進(jìn) mRNA 序列外，在簡(jiǎn)化 mRNA 生產(chǎn)方面也取得了重大進(jìn)展。目前臨床使用的合成mRNA使用噬菌體 RNA 聚合酶 T7從質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄而成。mRNA的poly A尾序列已經(jīng)編碼到質(zhì)粒DNA中，從而減少了反應(yīng)步驟，在降低生產(chǎn)時(shí)間的同時(shí)減少了材料損失。將poly A尾序列加入到質(zhì)粒DNA中同時(shí)解決了poly A尾合成長(zhǎng)度不一的問(wèn)題。通常，poly A尾長(zhǎng)度超過(guò)100個(gè)堿基對(duì)于治療性mRNA效果最佳，然而過(guò)長(zhǎng)的多腺嘌呤序列會(huì)破壞用于轉(zhuǎn)錄的質(zhì)粒DNA�？朔�該穩(wěn)定性問(wèn)題的解決方案是在poly A尾中添加UGC序列接頭。輝瑞/BioNTech的新冠疫苗BNT162b2就使用了這種接頭。

總之，這些創(chuàng)新克服了生產(chǎn)瓶頸，并促進(jìn)了一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)高效和可擴(kuò)展的一步 mRNA 合成工藝的開(kāi)發(fā)。
 

遞送mRNA疫苗的載體

因?yàn)閙RNA是一個(gè)包含負(fù)電荷的大分子，它無(wú)法穿過(guò)由陰離子脂質(zhì)雙層構(gòu)成的細(xì)胞膜，此外在體內(nèi)，它會(huì)被先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞吞噬并被核酸酶降解，因此它的體內(nèi)應(yīng)用需要使用遞送載體。目前的遞送載體包括以下幾種類(lèi)型：

一、脂質(zhì)納米顆粒

脂質(zhì)納米顆粒（LNP）是目前臨床上最先進(jìn)的mRNA遞送技術(shù)，目前所有獲得授權(quán)使用的新冠mRNA疫苗均采用LNP作為載體。LNP具有多種優(yōu)勢(shì)，包括易于配制、具有模塊性、生物相容性和mRNA載荷水平高。

LNP通常包含四種成分，可電離脂質(zhì)（ionizable lipid）、膽固醇、輔助磷脂和PEG化脂質(zhì)分子。它們結(jié)共同封裝保護(hù)脆弱的mRNA分子。

圖3 脂質(zhì)納米顆粒的主要脂質(zhì)成分[1]

可電離脂質(zhì)分子可以說(shuō)是LNP中最重要的成分，它們?cè)谒嵝原h(huán)境下攜帶正電荷，讓它們可以與攜帶負(fù)電荷的mRNA結(jié)合生成LNP。在生理pH值時(shí)它們呈中性，這提高了它們的安全性，并且延長(zhǎng)了它們?cè)谘�液循環(huán)中的駐留時(shí)間。在被細(xì)胞吞噬進(jìn)入內(nèi)體后，內(nèi)體的酸性環(huán)境會(huì)讓它們重新攜帶正電荷，從而促進(jìn)與內(nèi)體細(xì)胞膜的融合，將mRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中。
 

膽固醇通過(guò)填充脂質(zhì)之間的間隙來(lái)提高納米顆粒的穩(wěn)定性，并且?guī)椭�脂質(zhì)體與內(nèi)體細(xì)胞膜的融合。
 

輔助脂質(zhì)分子調(diào)節(jié)納米顆粒的流動(dòng)性，并且輔助與內(nèi)體的細(xì)胞膜融合。
 

PEG化脂質(zhì)可穩(wěn)定LNP，通過(guò)限制脂質(zhì)融合調(diào)節(jié)納米顆粒的大小，并通過(guò)降低與巨噬細(xì)胞的非特異性相互作用來(lái)提高納米顆粒的半衰期。
 

二、復(fù)合物和聚合物納米粒子
 

盡管在臨床進(jìn)展不如LNP迅速，但是聚合物與脂質(zhì)具有類(lèi)似的優(yōu)勢(shì)，并能有效遞送mRNA。陽(yáng)離子聚合物可以與mRNA形成不同大小的復(fù)合體。目前已經(jīng)有多種可以被生物降解的聚合物材料用于有效遞送mRNA，如聚乙烯亞胺、聚β-氨基酯、聚酰胺基胺。

圖4 遞送mRNA的聚合物納米顆粒[1]

三、其它遞送系統(tǒng)
 

除了基于脂質(zhì)和聚合物的載體外，多肽也可以被用于遞送mRNA，主要?dú)w功與其主鏈和側(cè)鏈中的陽(yáng)離子或雙親性胺基團(tuán)，可以與mRNA結(jié)合。

最后，基于角鯊烯（squalene）的陽(yáng)離子納米乳液也被用于遞送mRNA。這些納米乳液由一個(gè)基于角鯊烯的核心和一個(gè)脂質(zhì)外殼構(gòu)成。mRNA被吸附在納米乳液的表面。有些角鯊烯的配方可以起到佐劑的作用。例如諾華的MF59在FDA批準(zhǔn)的流感疫苗中作為佐劑。MF59導(dǎo)致注射部位的細(xì)胞分泌趨化因子，募集抗原呈遞細(xì)胞，誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞，并增強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞對(duì)抗原的攝取。

圖5 遞送mRNA的陽(yáng)離子納米乳液[1]
 

傳染病mRNA疫苗的進(jìn)展

在mRNA技術(shù)的臨床應(yīng)用方面，針對(duì)傳染病的疫苗開(kāi)發(fā)是進(jìn)展最快的方向。綜述指出，截至2021年6月18日，目前進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段的102種新冠疫苗中，有19款為mRNA疫苗。在新冠病毒之外，多款mRNA疫苗也已經(jīng)進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段，用于預(yù)防流感病毒、巨細(xì)胞病毒（CMV）、寨卡病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）、狂犬病毒等病原體的感染。針對(duì)不同的病原體，mRNA疫苗的開(kāi)發(fā)也會(huì)遇到不同的挑戰(zhàn)。包括病毒突變迅速（HIV病毒），高致死性（狂犬病毒），新病毒株和突變體的產(chǎn)生（流感病毒和新冠病毒）等等。因此mRNA疫苗的設(shè)計(jì)也需要做出相應(yīng)的調(diào)整，包括靶向抗原中保守的區(qū)域，攜帶多種突變體或者病毒株的抗原等等。

圖6 針對(duì)不同病原體開(kāi)發(fā)mRNA疫苗面對(duì)的挑戰(zhàn)和應(yīng)對(duì)策略[1]
 

mRNA疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵問(wèn)題

一、抗體反應(yīng)的持久性
 

有些mRNA遞送系統(tǒng)主動(dòng)靶向抗原呈遞細(xì)胞，讓它們成為生產(chǎn)抗原的“細(xì)胞工廠(chǎng)”。通過(guò)在LNP表面偶聯(lián)單克隆抗體或者與樹(shù)突狀細(xì)胞特異性結(jié)合的配體，在主動(dòng)遞送mRNA進(jìn)入抗原呈遞細(xì)胞方面已經(jīng)獲得可喜的效果。此外，通過(guò)延長(zhǎng)抗原性 mRNA 的翻譯來(lái)改變疫苗的藥代動(dòng)力學(xué)已成為增強(qiáng)抗體反應(yīng)的令人興奮的工具。
 

二、針對(duì)新興病毒變體的疫苗開(kāi)發(fā)
 

病毒基因組在復(fù)制時(shí)常常會(huì)發(fā)生突變。雖然大部分突變對(duì)病毒的功能沒(méi)有影響，但是有些突變可能增強(qiáng)免疫逃逸，限制疫苗的效力。目前，針對(duì)病毒突變的創(chuàng)新策略包括開(kāi)發(fā)靶向病毒保守區(qū)域的疫苗；或者讓疫苗編碼廣譜中和抗體。

三、安全性
 

總體來(lái)說(shuō)，mRNA疫苗的安全性特征良好，在臨床試驗(yàn)中只發(fā)現(xiàn)輕度或中度不良事件。綜述指出，疫苗造成的過(guò)敏反應(yīng)在接種輝瑞/BioNTech新冠疫苗人群中出現(xiàn)的比例大約為每百萬(wàn)次接種中出現(xiàn)4.7例，Moderna疫苗這一數(shù)值為2.5例/百萬(wàn)次接種。這個(gè)數(shù)值是更為傳統(tǒng)的疫苗的2-4倍。一種假設(shè)是過(guò)敏反應(yīng)歸因于LNP中使用的PEG化脂質(zhì)分子。由于人們此前使用過(guò)很多包含PEG的日用產(chǎn)品（例如牙膏、洗發(fā)露等等），身體中已經(jīng)存在針對(duì)PEG的抗體。這些抗體可能提高過(guò)敏反應(yīng)出現(xiàn)的可能性，并且限制疫苗的效力。因此，mRNA疫苗開(kāi)發(fā)領(lǐng)域需要對(duì)疫苗配方導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)的機(jī)制有更深入的了解，從而改進(jìn)配方，提高安全性特征。
 

四、特定人群的疫苗接種
 

孕產(chǎn)婦、兒童、老年人等特定人群由于其免疫系統(tǒng)的不同，一些病毒對(duì)其會(huì)產(chǎn)生更嚴(yán)重的影響，而mRNA疫苗在該類(lèi)人群中的使用也需要進(jìn)一步的縱向評(píng)估。

五、疫苗的可及性
 

疫苗的可及性是達(dá)到廣泛保護(hù)目的面對(duì)的最大挑戰(zhàn)，特別是在低收入國(guó)家。對(duì)于已經(jīng)獲得授權(quán)的mRNA新冠疫苗來(lái)說(shuō)，可及性進(jìn)一步受到冷藏條件的限制。如果要在全球范圍內(nèi)對(duì)幾十億人進(jìn)行接種，則需要耐熱性更好的疫苗。
 

六、展望未來(lái)
 

mRNA 設(shè)計(jì)和核酸遞送技術(shù)數(shù)十年的進(jìn)步，以及新抗原靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，使 mRNA 疫苗成為對(duì)抗新興流行病和現(xiàn)有傳染病的非凡工具。相信隨著科學(xué)的進(jìn)步和技術(shù)的發(fā)展，mRNA技術(shù)能夠獲得更為廣泛的應(yīng)用，造福廣大病患！

參考文獻(xiàn)

【1】Chaudhary N, Weissman D, Whitehead KA. mRNA vaccines for infectious diseases: principles, delivery and clinical translation. Nat Rev Drug Discov. 2021 Nov;20(11):817-838.