活細胞成像儀HoloMonitor M4在細胞周期研究的應用

了解細胞周期
 

細胞周期(cell cycle)是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經(jīng)歷的全過程。通常將子細胞形成作為一次細胞分裂結束的標志，細胞周期是指從一次細胞分裂形成子細胞開始到下一次細胞分裂形成子細胞為止所經(jīng)歷的過程。在這一過程中，細胞的遺傳物質(zhì)復制并均等地分配給兩個子細胞。

1.細胞周期的主要階段

細胞周期通常被分為四個主要階段。前三個階段通常被稱為間期，它們?yōu)榈谒膫�階段—有絲分裂做準備。
 

 

1.1 G1期—細胞生長

細胞體積不斷增加并增加mRNA、蛋白質(zhì)和細胞器的產(chǎn)量，為后續(xù)階段做準備。

1.2 S期—DNA合成

mRNA和蛋白質(zhì)的產(chǎn)量降低，細胞專注于復制其所有的DNA，為每條染色體創(chuàng)造一個副本。這兩個相同的拷貝，稱為姐妹染色體，在一個稱為中心點的地方相互連接在一起。
 

DNA已被復制，所以染色體由兩個相同的姐妹染色體組成，在中心點連接在一起。
 

1.3 G2期—為細胞分裂做準備

細胞繼續(xù)生長并合成最后階段所需的蛋白質(zhì)和細胞器。

1.4 M期—通過有絲分裂形成子細胞

核膜破裂，釋放出染色體。姐妹染色單體分離，形成兩個相同的細胞核，被拉到細胞的兩側(cè)。然后，它將細胞膜和細胞質(zhì)分成兩個相等的部分，將DNA和細胞器分在它們之間。兩個遺傳上完全相同的子細胞就這樣產(chǎn)生了。
 

1.5 離開細胞周期—G0期

細胞完成M期后，兩個子細胞再次進入G1期。從這里開始，它們可以繼續(xù)細胞周期并再次進行分裂，或者離開細胞周期并停止分裂。退出細胞周期的細胞進入G0期，它仍然具有完全的功能，但不再進行分裂。一些細胞永遠不會再離開G0期，如大多數(shù)神經(jīng)細胞，而其他細胞可以重新進入G1期，并在必要時繼續(xù)進行細胞周期。像大多數(shù)上皮細胞一樣，一些細胞從未進入G0期，但在其一生中繼續(xù)分裂。

2.細胞周期檢查點

為了確保細胞周期的每個階段都能正確進行，每個階段后有一個檢查點。細胞周期檢查點是一種控制機制，在細胞進入下一個步驟之前必須滿足某些條件。檢查點失敗會導致細胞周期停滯，阻止細胞在解決問題之前繼續(xù)進行。

目前，研究細胞周期的最常見方法是使用流式細胞術。然而，流式細胞術存在一些缺點：(1) 需要準備大量的細胞樣品，最終可能會造成細胞樣品的浪費；(2) 樣品必須為單細胞懸液；(3) 不能確定組織結構，一些罕見的大細胞難以分析；（4）無法檢測分泌蛋白等。
  因此，在細胞周期研究中，使用HoloMonitor®活細胞成像系統(tǒng)有幾個好處：它是完全非侵入性的，不使用細胞毒性的染色劑；它不需要任何樣品預處理；所研究的細胞不會被浪費，而是可以繼續(xù)使用；它可以直接在常規(guī)培養(yǎng)箱內(nèi)操作。
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分享具體案例
 

以下是使用HoloMonitor M4研究細胞周期的具體案例：

 

Externally added cystatin C reduces growth of A375 melanoma cells by increasing cell cycle time
 

半胱氨酸組織蛋白酶B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X（或Z）的天然抑制劑家族稱為胱抑素。人類胱抑素中含量最高的是胱抑素C。它是一種2型胱抑制素，存在于體液、組織和細胞中。胱抑素C對幾乎所有的半胱氨酸蛋白酶都有抑制作用。有研究表明，胱抑素可以調(diào)節(jié)細胞增殖，保護細胞免受誘導細胞死亡的氧化應激并可以影響細胞因子釋放。人體細胞生長和細胞內(nèi)蛋白水解受到天然分泌的胱抑素的影響，因此它可能被用于抑制腫瘤生長。

在這篇文章中，H.Wallin和同事采用HoloMonitor M4活細胞成像儀對A375黑色素瘤細胞增殖、細胞周期長度和細胞形態(tài)（面積和光學厚度）進行研究，旨在探討外部添加的胱抑素C是否能夠影響黑色素癌細胞的增殖，從而抑制腫瘤的生長。

2.1 胱抑素C對A375細胞增殖的影響

為了研究A375細胞群的生長，我們使用HoloMonitor M4活細胞成像儀實時跟蹤細胞。在48小時內(nèi)每小時拍攝一次全息圖像，在每個圖像中定義和計數(shù)細胞以繪制生長曲線（圖1）。與對照組細胞（146 000 ± 58 000）相比，5 µM胱抑素C的存在使細胞數(shù)減少到55%（81 000 ± 37 000）。以上結果表明，胱抑素C會降低A375細胞增殖率。

圖1 A375細胞生長曲線

2.2 胱抑素C對A375細胞形態(tài)（面積和光學厚度）的影響

為了探究胱抑素C是否會誘導細胞死亡，我們使用HoloMonitor M4研究了A375細胞與胱抑素C共培養(yǎng)的細胞形態(tài)學。在12和24小時后，與對照組相比，使用胱抑素C的培養(yǎng)物中的細胞數(shù)量明顯減少，但細胞看起來健康，并在整個實驗過程中繼續(xù)增殖（圖2A）。相比之下，在100 µM H2O2（已知可誘導A375細胞死亡）存在下培養(yǎng)的A375細胞面積較小且不增殖（圖2A）�；�本上，用H2O2處理的細胞在12小時后顯示出小面積和高厚度（圖2B）。另一方面，添加胱抑素C培養(yǎng)的A375細胞在面積和厚度方面與對照細胞相似。

以上表明胱抑素C不會誘導細胞死亡。

圖2 用H2O2或胱抑素C處理的細胞形態(tài)學。(A) 將A375細胞與H2O2或胱抑素C孵化，并在0、12和24小時后采集數(shù)字全息顯微鏡圖像，細胞厚度以顏色編碼顯示，如右側(cè)色條所示。(B)細胞的面積（µm）與平均光學細胞厚度（µm）的散點圖。
 

2.3 胱抑素C對A375細胞周期長度的影響

為了進一步研究外源胱抑素C對A375細胞分裂影響，使用HoloMonitor M4追蹤A375細胞。

對得到的每個細胞分裂的子細胞進行標記，并在后期圖像中繼續(xù)追蹤（圖3）。并由此構建生成樹和計算單個細胞的細胞分裂時間。

圖3. 使用HoloMonitor M4追蹤A375細胞分裂的數(shù)字全息圖像。（A，B）相隔5分鐘拍攝的相同位置的圖像。

圖4顯示了在培養(yǎng)基中沒有胱抑素C（左）或有胱抑素C（右）的情況下生長的A375細胞的生成樹的例子。當A375細胞在胱抑素C存在下培養(yǎng)時，細胞周期更長，細胞分裂次數(shù)更少。

圖4. 存在或不存在胱抑素C的情況下生長的A375細胞的生成樹
 

具體來看，A375細胞周期的時間存在明顯差異。一些細胞分裂的時間是細胞周期中位數(shù)的兩倍以上，特別是在細胞周期1和細胞在胱抑素C存在下生長的情況下（圖5A）。

在分析所有細胞時，48小時中完成的細胞周期數(shù)也有很大的變化。少數(shù)細胞（<5%）沒有移動或分裂。其他細胞周期短，分裂次數(shù)多。最常見的是3次完成的細胞分裂，無論是否添加胱抑素C（圖5B）。然而，在胱抑素C的存在下，只有11%的被追蹤的細胞成功地分裂了4次，而26%的對照組細胞出現(xiàn)了4次分裂，甚至有些細胞出現(xiàn)了5次分裂（圖5B）。
 

以上結果表明，外部添加的胱抑素C減少了A375細胞分裂的次數(shù)并增加了細胞周期時間，特別是第一個細胞周期。
 

圖5. 外部添加的胱抑素C增加了細胞周期時間，減少了A375細胞分裂的次數(shù)。
 

HoloMonitor M4采用高分辨率成像技術，它能夠?qū)崟r檢測和定量單個和整個細胞群并且無需事先提取細胞、染色或?qū)⒓毎�暴露于有害光源。該技術有可能發(fā)展成為一種快速且經(jīng)濟高效的癌癥治療效果臨床前監(jiān)測方法。在這篇文章中，使用HoloMonitor M4觀測可知，胱抑素C通過延長細胞周期時間影響黑色素瘤細胞生長。因此，胱抑素C具有調(diào)節(jié)癌細胞增殖的能力，并可能用于抑制腫瘤生長。

 

 

在細胞周期研究中，HoloMonitor M4除了上述案例中提及的能監(jiān)控細胞分裂次數(shù)和確定細胞周期長度以外，還能用于研究細胞周期阻滯、測量有絲分裂持續(xù)時間、捕捉異常細胞分裂以及研究細胞周期進展等。HoloMonitor M4可以精準定位單個細胞，提供完整的單細胞遷移軌跡，速率以及其他多達30種細胞形態(tài)學參數(shù)。除此之外，用戶可以從同一個實驗樣品中獲取其他相關信息，例如細胞形態(tài)參數(shù)，繁殖速率等，使其真正成為一款智能化、全性能、全自動的活細胞成像分析系統(tǒng)，為您帶來全新的活細胞成像體驗。
 

參考文獻：

[1] Wallin H, Hunaiti S, Abrahamson M. Externally added cystatin C reduces growth of A375 melanoma cells by increasing cell cycle time. FEBS Open Bio. 2021 Jun;11(6):1645-1658. doi: 10.1002/2211-5463.13162.