激光顯微切割小課堂：激光顯微切割實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的RNA提取
比較未經(jīng)處理的天然小鼠腦組織以及經(jīng)固定并染色的組織在使用紫外激光切片后的RNA質(zhì)量
評估不同制備方法
對于小腦組織切片RNA質(zhì)量的影響
由于自身的不穩(wěn)定性，RNA通常比DNA更難處理。RNA并不具備DNA穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。為了在處理RNA時保證優(yōu)良品質(zhì)，必須從優(yōu)質(zhì)材料開始，并在處理前后進(jìn)行特別仔細(xì)的質(zhì)量控制。所謂的RNA完整性指數(shù)（RIN）是RNA質(zhì)量的指標(biāo)[1]。根據(jù)1到10的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，RIN值為1表示RNA已完全分解，RIN值為10則表示RNA完好無損。簡言之，RIN數(shù)值越高，RNA質(zhì)量越高。只要可能，應(yīng)始終選用具有高RIN值的材料。
固定并染色樣品制備方法的影響以及后續(xù)紫外激光顯微切片對于小鼠腦組織切片（事后檢查）的影響描述如下。將冷凍保存且未經(jīng)處理的腦組織切片的RIN值與采用標(biāo)準(zhǔn)方案處理并分離的切片進(jìn)行比較。圖1顯示了從冷凍切片到RIN分析的樣品制備工作流程。
圖1：小鼠腦組織從冷凍切片到激光顯微切片再到RIN分析的樣品處理流程。
冷凍切片，然后進(jìn)行染色并固定
為了比較未經(jīng)處理的組織樣本與固定和染色的組織樣本，使用3組已知RIN完整指數(shù)（RIN）的冷凍保存小鼠腦組織。在-80°C冷凍保存后，將它們轉(zhuǎn)移到冷凍切片刀處，并在-35°C下孵育45分鐘，然后將組織在-18°C下平衡30分鐘，接著在-18°C下通過冷凍切片將其切成12µm的切片。小鼠腦組織切片分為兩組，并按以下方式處理。一個是對照組，直接冷凍在-80°C，另一組則進(jìn)行無RNase的紫外線處理PEN載玻片。這需要通過在室溫下短暫解凍切片并在冷卻至-20°C的75%乙醇溶液中固定2分鐘來，然后，立即用幾滴無菌過濾的甲酚紫(CV)染料溶液(含5%甲酚紫的純乙醇溶液)并輕輕來回移動孵育45秒。
在染色過程中，染料溶液會短暫排除，載玻片浸入一系列濃度遞增（75%、95%和100%）的乙醇溶液中，每次4秒鐘，最后固定在100%的乙醇溶液中（試驗(yàn)組）。完成固定和染色程序之后，將載玻片在裝有硅凝膠的干燥室中放置45分鐘，然后保存在-80°C的干燥箱中，等待進(jìn)行激光顯微切片。
紫外激光顯微切片
固定和染色之后，相關(guān)組織采用溫和且無污染的紫外激光顯微切片（UV LMD）進(jìn)行分離[2]。這需要使用顯微鏡的10倍物鏡對組織進(jìn)行標(biāo)記并分割成多個矩形，然后使用足夠能量的激光束通過“Draw + Cut”（繪圖切割）模式進(jìn)行完全消融。切割物收集在0.5ml的無RNase蓋帽中，以便對RNA內(nèi)容進(jìn)行提純。這些會保存在–80°C的環(huán)境下，等待進(jìn)行RNA分離。
RNA平行分離
兩組樣品，即保存在在 –80°C下未經(jīng)處理的樣品，以及經(jīng)固定、染色和激光顯微切片處理的樣品，接受平行解凍并同時用相同的試劑處理。按照制造商的說明使用Qiagen的RNase Mini Kit®進(jìn)行提純。提純的RNA使用30µl的無RNase水洗脫到新的無RNase試管中。
比較關(guān)系到RNA質(zhì)量的RIN值
為了比較天然冷凍組織切片與經(jīng)過CV染色、乙醇固定、激光顯微切割的組織切片的RNA質(zhì)量，將來自每個不同處理樣品的RNA放入同一RNA納米芯片（安捷倫生物分析儀）。RNA納米芯片通過毛細(xì)管凝膠電泳分離RNA樣品，并根據(jù)樣品在芯片上的移動方式對樣品質(zhì)量進(jìn)行分級。如前所述，RNA質(zhì)量表示為RIN值，其中10表示完全完整的RNA，1表示完全分解的RNA。
此處進(jìn)行的RIN分析（圖2中的樣品測量）表明，來自直接冷凍的天然組織的RNA樣品的RIN值與根據(jù)UV-LMD標(biāo)準(zhǔn)方案處理的RNA樣品的RIN值沒有太大差異。
RNA沉淀
緊接著將分離的RNA樣品分成兩組，每組中有一半的樣品進(jìn)行沉淀。在RNA沉淀后，根據(jù)參考文件3中提供的說明，來自天然冷凍組織的已沉淀樣品的RNA的RIN值略低于來自經(jīng)過CV染色、EtOH固定、UV-LMD處理的樣品的RNA的RIN值[3]。這種差異可能來自沉淀混合物的poly-I，因?yàn)槠渲幸恍┒替淩NA分子在芯片中進(jìn)行RIN測量時會被提純并與其他RNA一起檢測，并計(jì)入分解部分。在qPCR 反應(yīng)中，poly-I沒有產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，經(jīng)過固定、染色以及紫外激光顯微切片的腦組織切片有沒有進(jìn)行RNA沉淀，都不會影響其質(zhì)量。圖2顯示了未經(jīng)處理的天然小鼠腦組織切片和經(jīng)過固定并染色的小鼠腦組織切片在RNA質(zhì)量方面的比較結(jié)果
圖2：比較未經(jīng)處理的天然小鼠腦組織切片和經(jīng)固定并染色的小鼠腦組織切片的RNA質(zhì)量：本例顯示了從天然冷凍組織（天然）和經(jīng)CV染色、EtOH固定和UV-LMD切片處理的相同小鼠腦組織中分離出的RNA樣品，在RNA沉淀前后的虛擬RNA凝膠圖（左）和安捷倫RNA芯片的相關(guān)電泳圖（右）。電泳圖來自熒光單位 (FU) 隨著時間的推移（以秒[s]為單位）的結(jié)果[4，5]。
結(jié) 論總而言之，實(shí)驗(yàn)表明使用所述方法進(jìn)行紫外激光顯微切割[2]，不會顯著影響冷凍保存的腦組織的RNA質(zhì)量。這種技術(shù)提供了一種合理的樣品制備方法，并實(shí)現(xiàn)了單個細(xì)胞的非破壞性分離，從而獲得質(zhì)量一致的RNA。
相關(guān)產(chǎn)品
References：
1.A. Schroeder, O. Mueller, S. Stocker, R. Salowsky, M. Michael, M. Gassmann, S. Lightfoot, W. Menzel, M. Granzow, T. Ragg, The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements, BMC Molecular Biology (2006) vol. 7, iss. 1, art. 3, DOI: 10.1186/1471-2199-7-3.
2.J. Gründemann, F. Schlaudraff, B. Liss, UV-Laser Microdissection and mRNA Expression Analysis of Individual Neurons from Postmortem Parkinson’s Disease Brains. In: Murray, G. (eds) Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology, vol. 755 (Humana Press, 2011), pp. 363-374, DOI: 10.1007/978-1-61779-163-5_30.
3.B. Liss, Improved quantitative real‐time RT–PCR for expression profiling of individual cells, Nucleic Acids Research (2002) vol. 30, iss. 17, e89, DOI: 10.1093/nar/gnf088.
4.Schlaudraff F, Gründemann J, Fauler M, Dragecivic E, Hardy J, and Liss B, Orchestrated increase of dopamine and PARK mRNAs but not miR-133b in dopamine neurons in Parkinson’s disease, Neurobiology of Aging (2014) vol. 35, iss. 10, pp. 2302-2315, DOI: 10.1016/j.neurobiolaging.2014.03.016.
5.Duda J, Fauler M, Gründemann J, Liss B, Cell-Specific RNA Quantification in Human SN DA Neurons from Heterogeneous Post-mortem Midbrain Samples by UV-Laser Microdissection and RT-qPCR, Methods Mol. Biol. (2018) vol. 1723, pp. 335-360, DOI: 10.1007/978-1-4939-7558-7_19.
