增強NIR Ⅱ成像：超穩(wěn)定熒光染料花菁@白蛋白

本文要點：近紅外二區(qū) (NIR-II) 染料可以被外源性或內(nèi)源性白蛋白包裹，形成用于深部組織生物成像的穩(wěn)定復(fù)合物。本文確定了控制花菁染料與白蛋白超分子/共價結(jié)合的幾個關(guān)鍵參數(shù)：含Cl的六元環(huán)、小尺寸側(cè)鏈和相對較高的疏水性。設(shè)計的熒光團(tuán)(IR-780@albumin) 具有顯著增強的光穩(wěn)定性，可作為 NIR-II生物成像的長效成像探針。本文研究表明，含氯花菁染料（例如 IR-780）可以更有效地嵌入白蛋白中，從而產(chǎn)生更穩(wěn)定的熒光探針。這一發(fā)現(xiàn)部分解決了臨床上可用的花菁染料的光漂白問題，豐富了 NIR-II生物成像和手術(shù)導(dǎo)航的探針庫。

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先前研究已經(jīng)證明了含氯花菁染料和白蛋白之間通過共價鍵結(jié)合。然而，目前仍然缺乏對結(jié)合機制的詳細(xì)研究來指導(dǎo)穩(wěn)定探針的形成。

 

作者首先篩選了一個與白蛋白結(jié)合的花菁染料庫，并在測試了亮度增強效應(yīng)。如Figure 1B所示，通過比較在DMSO、PBS和BSA中的9種染料的亮度，發(fā)現(xiàn)花菁染料@BSA與在DMSO中相比可以恢復(fù)部分亮度，而在PBS中由于ACQ效應(yīng)而聚集淬滅。IR-783@BSA、IR-808@BSA和 IR-780@BSA與其他染料相比具有更高的熒光增強（Figure 1C）。接著優(yōu)化了染料和 BSA 的摩爾比，1：1結(jié)合有最佳的亮度增強效果（Figure 1D）。IR-780@BSA 光穩(wěn)定性顯著提高，在 NIR-II窗口下半衰期超過25 min （Figure 1E）。IR-780@BSA 的紅移和熒光增強可能是受限扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)的影響（Figure 1F&G）。

 

高濃度的花菁染料@BSA對激光的耐受性更高（Figure 2A&B），其中IR-780@BSA在所有反應(yīng)濃度下都比IR-783@BSA更穩(wěn)定。作者進(jìn)一步選擇了三種組合：花菁:BSA = 1:1（100μM）；花菁:BSA = 2:1（100μM）；花菁:BSA = 1:1（200μM），比較了亮度衰減的時間點（t）和亮度（B），結(jié)論是光穩(wěn)定性主要由花菁@BSA的濃度決定，過量的花菁會淬滅花菁@BSA的亮度并延長亮度衰減的時間點。

 

接下來探索了花菁@BSA體系的光穩(wěn)定性，在模擬血液環(huán)境下，體系濃度為10 ~ 400μM（Figure 2C，Group 1,2）。當(dāng)花菁與蛋白質(zhì)比例小于1時，PBS和BSA中的光穩(wěn)定性趨勢相似，表明當(dāng)花菁與BSA完全結(jié)合時，花菁@BSA熒光團(tuán)不受緩沖液環(huán)境的影響（Figure 2C，中間）。摩爾比>1的花菁@BSA體系中，游離花菁可以淬滅熒光團(tuán)亮度，而純花菁@BSA可以保持初始亮度（Figure 2C，右）。因此，BSA緩沖液可以通過與游離花菁結(jié)合而提高花菁@BSA體系（摩爾比 >1）的亮度。

 

稀釋后（Group 1）和10μM 花菁@BSA體系（Group 3）之間的相似趨勢證明，濃度可以影響光穩(wěn)定性但不改變結(jié)合性質(zhì)。對于摩爾比>1的花菁@BSA體系，BSA緩沖液稀釋（Group 2）比PBS（Group 1）以及10μM反應(yīng)體系（Group 3）中更具光穩(wěn)定性。此外，IR-780在不同濃度BSA中的吸收和發(fā)射光譜表明，亮度主要由IR-780和BSA之間的相互作用主導(dǎo)。雖然峰值發(fā)射（800−850 nm）隨著BSA的增加而增加，但當(dāng)BSA:IR-780 > 1時，超過850 nm的尾部發(fā)射強度是等效的（Figure 2D）。作者還比較了高濃度 (400μM)花菁@BSA被PBS稀釋前后的亮度（Figure 2E）。

 

進(jìn)一步研究了IR-780/IR-783與BSA結(jié)構(gòu)域 I (DI)、結(jié)構(gòu)域 II (DII) 和結(jié)構(gòu)域 III (DIII) 之間的結(jié)合能力。Figure 3A&C所示，花菁@DIII比花菁@DI和花菁@DII亮得多。從電泳結(jié)果 (Figure 3B, D) 來看, DI和DIII都可以有效地與花菁染料形成共價鍵。室溫下在較短的反應(yīng)時間里，含氯化物的花菁染料也可以與 DIII 共價結(jié)合，而與DI共價結(jié)合需要更長的反應(yīng)時間。然而，共價結(jié)合并沒有提高染料@DI的亮度。從光譜數(shù)據(jù)（Figure 1F、G ）來看，DI和DIII表現(xiàn)出與BSA相同的促進(jìn)吸收峰紅移的效果，但只有DIII同時增強了吸收和發(fā)射強度。

 

為了準(zhǔn)確理解花菁與白蛋白或白蛋白片段之間的作用機制，作者利用商業(yè)化花菁染料（ICG, IRdye800CW, IR-775, IR-780, IR-783, IR-797, IR-806, IR-808, and IR-820）系統(tǒng)分析。比較九組花菁@蛋白的亮度數(shù)據(jù)（Figure 4A），亮度的增強并不依賴共價結(jié)合。Figure 4C表明DIII是主要的結(jié)合位點，DI使第二結(jié)合位點。花菁與蛋白之間有效的超分子作用的對于穩(wěn)定TICT至關(guān)重要，因此增量了NIR-II亮度。Figure 4B電泳分析結(jié)果表明，含氯環(huán)己烯基團(tuán)的花菁（IR-775, IR-780, IR-783, IR-808）和BSA，HAS，DIII有完整的相互作用，而IR-820是個特例。因此，作者合理推測萘的空間位阻阻擋了IR-820與血清蛋白之間的接觸，從而降低了有限時間內(nèi)共價結(jié)合程度。IR-820與DIII的相互作用程度較高證實了這一假設(shè)。

 

此外，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)不含Cl的染料（IRdye800CW，ICG）沒有觀察到與蛋白的結(jié)合�；�于這一點，作者假設(shè)位阻和親水性阻止了有效的超分子作用。ICG與BSA、HAS結(jié)合后亮度增強，但與結(jié)構(gòu)域結(jié)合沒有明顯變化。這進(jìn)一步表明，整個白蛋白的疏水口袋對于錨定含氯和不含氯的染料都是必不可少的，而 DIII 需要共價結(jié)合才能有效地“鉤住”含氯染料。然后比較了含Cl染料，包括五元環(huán) (IR-797, IR-806) 和六元環(huán) (IR-775, IR-783)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)花菁染料與五元環(huán) (IR-797, IR-806)僅形成部分共價結(jié)合。

 

作者進(jìn)行了分子對接，并用長時間分子動力學(xué)模擬（MD）確認(rèn)了染料與BSA之間理想的結(jié)合模式（Figure 5）。如Figure 5所示，IR-783@BSA與IR-808@BSA的結(jié)合位點相同，但是IR-780@BSA不同，它有一個更緊的口袋，這意味著更強的結(jié)合。三個探針的相對結(jié)合自由能分別是-47.56, -42.13, and -36.14 kcal/mol，這與實驗觀察一致。

 

作者分析了探針的基礎(chǔ)代謝（Figure 6A-D）。靜脈注射IR-780@BSA后，探針快速積累在肝臟，然后在全身分布，隨后糞便排泄，與游離IR-780的肝膽代謝方式相同（Figure 6A&B）。然后評估了IR-780@DI和IR-780@DIII的體內(nèi)行為。由于尺寸較小，這兩種結(jié)構(gòu)域衍生的探針都表現(xiàn)出腎臟排泄途徑（Figure 6C、D）。盡管 IR-780@DI和IR-780@DIII給藥小鼠的腎臟信號沒有太大差異，但I(xiàn)R-780@DIII 的腎臟與皮膚比值在24~96 h內(nèi)更為顯著（Figure 6F）。隨后追蹤了不同花菁@BSA的體內(nèi)行為，并證明探針的代謝行為與共價鍵合的程度有關(guān)。不含Cl 花菁@血清蛋白顯示出快速的肝膽消除，與游離染料類似。含Cl 花菁@血清蛋白的代謝時間與光穩(wěn)定性結(jié)果一致（Figure 6B）。體內(nèi)代謝行為可以間接反映花菁@BSA的光穩(wěn)定性特征。

 

最后進(jìn)行淋巴結(jié)成像以評估NIR-II成像能力。使用三種花菁@BSA（IR-780@BSA，IR-808@BSA，IR-783@ BSA）和臨床使用的ICG研究了淋巴結(jié)成像的光穩(wěn)定性。IR-780@BSA在四個測試探針中仍然最穩(wěn)定（Figure 6G）。IR-780@BSA（1 mM，25 μL）為腘窩淋巴結(jié)可視化提供了穩(wěn)定的NIR-II成像，并且在長達(dá)60 min的連續(xù)激光照射中沒有觀察到信號衰減（Figure 6G）。在左腳掌注射IR-780@BSA以及右側(cè)注射ICG，腘窩和骶骨淋巴結(jié)在俯臥位清晰地勾勒出來。成像時間測試長達(dá)6小時（淋巴結(jié)與皮膚比值≥3.6），滿足了長時間成像導(dǎo)航手術(shù)（Figure 6H，I）。

 

參考文獻(xiàn)

Bai, L.; Hu, Z.; Han, T.; Wang, Y.; Xu, J.; Jiang, G.; Feng, X.; Sun, B.; Liu, X.; Tian, R.; Sun, H.; Zhang, S.; Chen, X.; Zhu, S., Super-stable cyanine@albumin fluorophore for enhanced NIR-II bioimaging. Theranostics 2022, 12 (10), 4536-4547.

 

 

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