InnoScan® 910掃描儀與SurePrint G3 CGH微陣列的兼容性分析詳解

概述
 
用于確定染色體拷貝數(shù)變異 (CNV) 的微陣列 CGH 分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究和診斷的常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)�？焖贉�(zhǔn)確地分析患者樣本對(duì)于鑒定基因組不穩(wěn)定性至關(guān)重要。在圖盧茲 Purpan 醫(yī)院，細(xì)胞遺傳學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室測(cè)試了 INNOPSYS公司 InnoScan 910 掃描儀與  SurePrint G3 人類 CGH 微陣列的聯(lián)合使用。安捷倫高密度 (HD) 寡核苷酸芯片包含排列在六邊形網(wǎng)格上的探針點(diǎn)，點(diǎn)徑大小為 30µm，偶數(shù)行的偏移為 31.75µm。高密度芯片需要高分辨率掃描，以確保檢測(cè)到足夠的熒光信號(hào)。InnoScan 910 掃描儀是用于高密度芯片掃描，高分辨率、低噪音和自動(dòng)對(duì)焦的微陣列掃描儀。其光學(xué)系統(tǒng)允許以高達(dá) 1µm/像素的分辨率同時(shí)檢測(cè) 532 nm 和 635 nm 信號(hào)。除了高分辨率和高靈敏度外，InnoScan 910 掃描儀還在速度和易用性方面具有優(yōu)勢(shì)。 INNOPSYS已經(jīng)為 8x60K 或 4x180K 規(guī)格的高密度寡核苷酸芯片開(kāi)發(fā)了特定的掃描設(shè)置。為了驗(yàn)證 InnoScan 910 掃描儀與安捷倫 8x60K 陣列的匹配性，圖盧茲 Purpan 醫(yī)院的醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)服務(wù)部門對(duì)已知染色體異常的 4 名男性和 4 名女性樣本進(jìn)行了測(cè)試。質(zhì)量控制和預(yù)期染色體異常被認(rèn)為是驗(yàn)證過(guò)程的關(guān)鍵點(diǎn)。


材料與方法
 
按照供應(yīng)商推薦的操作程序從血液樣本中分離基因組 DNA。為了減少染料摻入和檢測(cè)偏差，進(jìn)行染料交換實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，每一樣本分兩份分別用 Cy5 和 Cy3 染料標(biāo)記。在雜交反應(yīng)中混合等量的 Cy3 標(biāo)記或 Cy5 標(biāo)記的對(duì)照正常DNA樣品（圖 1）。然后根據(jù)制造商說(shuō)明（7.4 版，2015 年 8 月）將混合樣品與安捷倫 8x60K 寡核苷酸陣列一起孵育。雜交和洗滌步驟后，芯片立即在 INNOPSYS InnoScan 910 微陣列掃描儀中進(jìn)行掃描。
   
INNOPSYS開(kāi)發(fā)了用于高密度寡核苷酸陣列的自動(dòng)化設(shè)置模式。在自動(dòng)設(shè)置模式下使用 Oligo 8x60K 載玻片，掃描在適當(dāng)?shù)膾呙鑳x參數(shù)下自動(dòng)完成，以獲得符合安捷倫 QC 指標(biāo)的最佳信號(hào)。掃描結(jié)果 16 位圖像導(dǎo)入Agilent Cytogenomics© 軟件(v2.9.2.4) 進(jìn)行分析。由于染料交換設(shè)計(jì)，對(duì)于每個(gè)樣本，只有在Cy3- 和 Cy5- 標(biāo)簽中都存在那些事件才被視為真正的染色體 CNV。
 
 
 結(jié)果與討論
 
質(zhì)控指標(biāo)
所有 QC 指標(biāo)均在安捷倫細(xì)胞基因組學(xué) QC 標(biāo)準(zhǔn)的“優(yōu)秀”或“良好”閾值范圍內(nèi)（圖 2）。最小和最大 DLR 值分別為 0.135 和 0.185。這些結(jié)果證明 InnoScan 910 掃描儀與安捷倫細(xì)胞基因組學(xué)軟件的兼容性。結(jié)果還表明，使用 Oligo 8x60K 掃描配置獲得的圖像信號(hào)符合確保高質(zhì)量結(jié)果所需的推薦指標(biāo)。    
 
 染料交換分析和數(shù)據(jù)驗(yàn)證
 
由于它們的化學(xué)特性 Cy3 和 Cy5 沒(méi)有相同的摻入率，也沒(méi)有相同的熒光活性。即使標(biāo)準(zhǔn)化程序可以減少這些偏差，以確保結(jié)果的可靠性，也可以選擇染料交換實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。在染料交換設(shè)計(jì)中，每個(gè)患者DNA樣本分成兩份，分別標(biāo)記Cy5 或 Cy3。正常人對(duì)照DNA也分別標(biāo)記 Cy5 或 Cy3 。將標(biāo)有不同熒光染料的患者DNA 和正常對(duì)照DNA進(jìn)行混合，獲得兩份混合樣品。兩份混合樣品分別在芯片的兩個(gè)陣列中雜交（圖 1）。只有那些相反的事件（刪除和復(fù)制）被認(rèn)為是重要的（圖 3）。將最終結(jié)果與每個(gè)樣本經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的染色體變化進(jìn)行比較（表 1）。發(fā)現(xiàn)了所有預(yù)期變化，出現(xiàn)了一些新的變化，但這些是由于芯片的基因組設(shè)計(jì)所致。這些結(jié)果證明 InnoScan® 910掃描儀兼容Agilent oligo G3 CGH 微陣列。  
圖 3. 染料交換分析。 3例女性患者樣本，4例男性患者樣本的CytoGenomics 軟件代表性數(shù)據(jù)分析。只有多樣本分析中的相反事件才被認(rèn)為是顯著的。
 
 
 表1. 結(jié)果驗(yàn)證           

樣品	預(yù)期的染色體變化	檢測(cè)到的染色體變化
女性樣品 1	del 4q35.2 (850 kb)	del 4q35.2 (624-707 kb) dup 15q11.1-q11.2 (2 Mb) dup 17q21.3 (134 kb)
女性樣品 2	del 13q12.12 (473 kb)	del 13q12.12 (421 kb)
女性樣品 3	dup 22q11.21q11.23 (2.5 Mb)	dup 22q11.21-q11.23 (2.51 Mb)
女性樣品 4	dup 1q21.21- 1q21.2 (5.5Mb) dup 21q21.1 (314 kb)	dup 1q21.1 – q21.2 (4.29 Mb) del 15q11.1 –q11.2 (2Mb) dup 20p12.3 (210 kb)  dup 21q21.1 (375-439kb)
男性樣品 1	del 15q13.3 (663 kb)	del 15q13.3 (538 kb) del 8p11.22 (127-183 kb)  dup 11p15.4 (114-145 kb)
男性樣品 2	dup 15q11.2 15q13.3 (10.2Mb)	dup 15q11.1 – q13.3 (12.2 Mb)
男性樣品 3	del 13q33.1q33.2 (1.58 Mb)	del 13.33.1 – q33.2 (1.4 Mb)
男性樣品 4	dup 17q12 (1.3 – 1.6 Mb)	dup 17q13 (1.4 Mb)

 
                                                         
 結(jié)論

用于確定拷貝數(shù)變異的微陣列 CGH 分析已成為一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以更好地定義細(xì)胞遺傳學(xué)染色體重排的斷點(diǎn)，并識(shí)別或確認(rèn)染色體畸變。目前的分析證明INNOPSYS  InnoScan 910 掃描儀在掃描 Agilent Surprint G3 CGH 微陣列方面的兼容性。使用 Oligo 8x60K 芯片設(shè)置，高密度微陣列掃描變得自動(dòng)化且易于使用。
 

免責(zé)聲明
InnoScan® 是 INNOPSYS 的注冊(cè)商標(biāo)
Agilent SurePrint™ 和 Cytogenomics© 是安捷倫科技公司的商標(biāo)或注冊(cè)商標(biāo)。