文獻(xiàn)解讀：DNA甲基化對(duì)橙、番茄、草莓果實(shí)成熟的重要作用

大家好，這里是專注表觀組學(xué)十余年，領(lǐng)跑多組學(xué)科研服務(wù)的易基因。本期我們通過3篇高分文章來聚焦DNA甲基化對(duì)果實(shí)成熟的重要作用。
 

01  橙果實(shí)發(fā)育

標(biāo)題：Global increase in DNA methylation during orange fruit development and ripening（甜橙果實(shí)發(fā)育和成熟過程中全基因組DNA甲基化增加）
期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.
2021影響因子: 11.205
發(fā)表時(shí)間：2019.01
方法：WGBS、RNA-seq

摘要
DNA甲基化是參與許多生物過程的重要表觀遺傳標(biāo)記。已有研究表明，番茄在成熟過程中全基因組DNA甲基化會(huì)顯著降低，但其他水果的成熟是否與全基因組DNA去甲基化有關(guān)還尚不清楚。作者鑒定了甜橙果實(shí)的單堿基分辨DNA甲基化情況。與未成熟的甜橙果實(shí)相比，成熟的甜橙果實(shí)在3萬多個(gè)基因組區(qū)域獲得了DNA甲基化，在大約1000個(gè)基因組區(qū)域失去DNA甲基化，這表明在甜橙果實(shí)成熟過程中全基因組DNA甲基化顯著增加。DNA甲基化的增加與DNA去甲基酶基因表達(dá)的降低有關(guān)。DNA甲基化抑制劑的應(yīng)用干擾了甜橙果實(shí)的成熟，這表明DNA高甲基化是甜橙果實(shí)能夠正常成熟的關(guān)鍵。作者發(fā)現(xiàn)，成熟相關(guān)的DNA高甲基化與數(shù)百個(gè)基因(如光合作用基因)的抑制和數(shù)百個(gè)基因(包括與脫落酸反應(yīng)有關(guān)的基因)的激活有關(guān)。作者的結(jié)果表明DNA甲基化在甜橙果實(shí)成熟過程中起著重要作用。
 
材料
紐荷爾甜橙(Citrus Sinensis Osbeck)果實(shí)，采集了開花后90、120、150、180和210d的五個(gè)不同發(fā)育階段的果實(shí)。采集橙果皮，并保存在−80°C，用于DNA和RNA的提取。
 
結(jié)果
為了研究甜橙果實(shí)發(fā)育過程中DNA甲基化的動(dòng)態(tài)變化，作者根據(jù)甜橙果實(shí)發(fā)育和成熟的時(shí)間，將果實(shí)分為開花后90d、120d、150d、180d和210d五個(gè)不同的階段(以下簡(jiǎn)稱CS1∼CS5)進(jìn)行單堿基分辨的全基因組DNA甲基化分析(圖1A)。
 
作者發(fā)現(xiàn)DNA甲基化的增加主要是由于CHH甲基化的增加(圖1B)。為了研究未成熟與成熟水果間的差異，作者比較了CS1和CS5兩個(gè)階段的DNA甲基化情況。如圖1C所示，主成分分析(PCA)顯示在每個(gè)階段兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)具有很好的一致性。作者發(fā)現(xiàn)CS5中相對(duì)于CS1總共有120萬個(gè)DMC，其中88%是高甲基化(hyper-DMC)，并且93%的高甲基化發(fā)生在CHH背景下，這表明CHH DNA甲基化主要從CS1增加到CS5(圖1D)。
 

圖1

 
由于在擬南芥、水稻胚乳、番茄發(fā)育過程中，整體的低甲基化會(huì)伴隨著局部的高甲基化。作者想知道在橙子成熟過程中是否也存在同樣的現(xiàn)象。進(jìn)一步研究表明橙子果實(shí)成熟過程中CHH的高甲基化并不伴隨CG的低甲基化(圖2)。而且甜橙果實(shí)發(fā)育和成熟期間全基因組DNA甲基化增加，與番茄果實(shí)成熟期間全基因組DNA甲基化減少形成鮮明對(duì)比。
 

圖2

 
DNA甲基化狀態(tài)可由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和DNA去甲基酶活性動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。甜橙果實(shí)發(fā)育成熟過程中DNA甲基化增加可能是由于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)或DNA脫甲基酶活性降低所致。為了研究這些可能性，作者檢測(cè)了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和脫甲基酶基因在甜橙果實(shí)發(fā)育和成熟不同階段的表達(dá)水平。結(jié)果表明，成熟過程DNA脫甲基酶基因表達(dá)減少可能是引起DNA甲基化增加的原因(圖3)。
 

圖3

通過對(duì)DNA高甲基化相關(guān)基因分析，作者發(fā)現(xiàn)數(shù)百個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化與基因表達(dá)的陽性和陰性變化均有關(guān)聯(lián)，分析表明：參與光合作用、細(xì)胞壁維持和發(fā)育的基因下調(diào)；脫落酸信號(hào)傳導(dǎo)（對(duì)成熟很重要）以及類固醇和芳香族代謝相關(guān)基因的上調(diào)。并且將DNA甲基化抑制劑注射到甜橙果皮中可以阻止橙子脫綠（成熟）(圖4)。
 

圖4
 

 02  番茄果實(shí)發(fā)育

標(biāo)題：Critical roles of DNA demethylation in the activation of ripening-induced genes and inhibition of ripening-repressed genes in tomato fruit（DNA去甲基化在番茄果實(shí)成熟誘導(dǎo)基因激活和成熟抑制基因抑制中的關(guān)鍵作用）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.
2021影響因子: 11.205
發(fā)表時(shí)間：2017.05
方法：CRISPR/Cas 9、WGBS、RNA-seq
 
摘要
DNA甲基化是一種保守的表觀遺傳標(biāo)記，對(duì)植物和哺乳動(dòng)物基因組的完整性、發(fā)育和環(huán)境反應(yīng)非常重要。植物中活躍的DNA去甲基化是由一系列5-mC DNA糖基化酶/裂解酶(即DNA去甲基酶)啟動(dòng)的。最近的報(bào)道表明，活躍的DNA去甲基化在番茄果實(shí)成熟過程中起著重要作用。在本研究中，作者獲得了番茄基因SlDML2的功能缺失突變體，該基因與擬南芥DNA去甲基酶基因ROS1同源。在番茄突變體的果實(shí)中，發(fā)現(xiàn)數(shù)千個(gè)基因的DNA甲基化增加。這些基因不僅包括數(shù)百個(gè)成熟誘導(dǎo)基因，還包括許多成熟抑制基因。作者的結(jié)果表明SlDML2在番茄果實(shí)成熟過程中起著關(guān)鍵作用，成熟誘導(dǎo)基因的激活和成熟抑制基因的抑制都需要活躍的DNA去甲基化。

材料
本研究所用植物材料均為第一代(T0)愈傷組織再生植株。所有的組織培養(yǎng)步驟都是在室溫下進(jìn)行的，光周期為16h光照，8h黑暗。

結(jié)果
作者利用CRISPR/Cas 9技術(shù)獲得了番茄sldml2突變體，與WT植株的果實(shí)成熟相比，sldml2突變體的果實(shí)成熟明顯受到抑制(圖1)。
 

圖1

在sldml2突變體中，高DMR的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于低DMR的數(shù)量，這與推測(cè)SlDML2在DNA去甲基化中的功能是一致的。為了研究SlDML2在DNA去甲基化中的作用，作者重點(diǎn)研究了sldml2突變體中的高DMR(圖2)。SlDML2基因與擬南芥中的DNA去甲基化酶基因ROS1高度同源。
 

圖2

 
作者分析了番茄品種果實(shí)成熟過程中DNA甲基化的變化，通過對(duì)比野生型與突變體間成熟過程中的差異甲基化區(qū)域（高甲基化、低甲基化區(qū)域），發(fā)現(xiàn)SlDML2是果實(shí)成熟誘導(dǎo)的DNA去甲基化所必需的(圖3)。由于該基因的失活，使得全基因組范圍內(nèi)的甲基化水平升高，誘導(dǎo)果實(shí)成熟的基因表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致番茄果實(shí)不能正常成熟。
 

圖3

進(jìn)一步研究表明，SlDML2 參與了色素合成、口味形成、乙烯生物合成及信號(hào)傳導(dǎo)途徑、細(xì)胞壁水解等調(diào)節(jié)機(jī)制，還參與調(diào)控了成熟相關(guān)基因的表達(dá)。另外，作者還發(fā)現(xiàn)，SlDML2介導(dǎo)的DNA去甲基化也抑制了部分參與光合作用及細(xì)胞壁合成的基因表達(dá)，這些基因大多是果實(shí)成熟所不需要的。
 
03  草莓果實(shí)發(fā)育

標(biāo)題：Downregulation of RdDM during strawberry fruit ripening（草莓果實(shí)成熟過程中RdDM的下調(diào)）

期刊：Genome biology
2021影響因子: 13.583
發(fā)表時(shí)間：2018.12
方法：MS-PCR、WGBS、RNA-seq、sRNA-seq、VIGS

背景
近年來，DNA甲基化被多項(xiàng)研究證實(shí)與調(diào)控肉質(zhì)果實(shí)的成熟有關(guān)。肉質(zhì)水果可以根據(jù)其成熟過程區(qū)分為躍變期水果，如西紅柿；或非躍變期水果，如草莓。由于DNA脫甲基酶基因的表達(dá)增加，番茄在成熟過程中DNA甲基化水平整體下降。但非躍變期果實(shí)成熟過程中DNA甲基化的變化情況和生物學(xué)相關(guān)性尚不清楚。

材料
草莓(Fragaria × ananassa Duch. cv. Hongjia)是在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海寧科研創(chuàng)新基地種植的。收獲了三個(gè)發(fā)育階段的果實(shí)(Fa1，綠色期，開花后約20天(DAB)；Fa2，中間紅期，30DAB；Fa3，全紅期，35DAB)。在收獲當(dāng)天轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室后，選擇了大小均勻、沒有明顯缺陷的果實(shí)。每個(gè)發(fā)育階段使用兩個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8-12個(gè)果實(shí)。

結(jié)果
作者整合了未成熟和成熟時(shí)期草莓全基因組DNA甲基化分析結(jié)果，觀察到草莓果實(shí)成熟過程中DNA甲基化會(huì)整體下調(diào)(圖1、2)，因此，成熟誘導(dǎo)的DNA低甲基化不僅發(fā)生在躍變型果實(shí)中，也發(fā)生在非躍變型果實(shí)中。
 

圖1
 

圖2
 

作者發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化抑制劑能夠?qū)е虏葺�果�?shí)的早熟表型，這表明DNA甲基化下調(diào)對(duì)草莓果實(shí)的成熟非常重要(圖3)。
 

圖3
 

另外，分析發(fā)現(xiàn)DNA甲基化下調(diào)區(qū)域富集在基因啟動(dòng)子區(qū)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析揭示了DNA甲基化可能通過調(diào)控成熟相關(guān)基因的表達(dá)從而調(diào)控草莓成熟 (圖4)。
 

圖4
 

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)番茄和草莓成熟過程中DNA低甲基化的機(jī)制是不同的，與西紅柿不同，草莓在成熟過程中去甲基化酶基因不會(huì)上調(diào)，而參與RNA介導(dǎo)的DNA甲基化通路（RdDM）在草莓成熟過程中下調(diào)。此外，成熟誘導(dǎo)的DNA低甲基化與siRNA水平降低有關(guān)，這與RdDM活性降低一致(圖5)。

圖5
 

作者的發(fā)現(xiàn)為研究非躍變期果實(shí)成熟過程中DNA甲基化動(dòng)態(tài)提供了新的視角，并說明RdDM在調(diào)節(jié)植物發(fā)育中的一個(gè)重要過程中的新功能。
 
參考文獻(xiàn)：
https://www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1815441116
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1705233114
https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-018-1587-x