空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用盤點(diǎn)及其新進(jìn)展

01

痛覺感受神經(jīng)調(diào)控杯狀細(xì)胞粘液分泌保護(hù)腸道黏膜新機(jī)制

痛覺感受神經(jīng)（Nociceptors）起源于背根神經(jīng)節(jié)和迷走神經(jīng)節(jié)，在腸道組織中分布廣泛作為腦腸軸的重要組成部分，神經(jīng)元-腸道上皮細(xì)胞互作可以將腸道中的損傷以疼痛等信號傳遞至大腦，對于腸道黏膜穩(wěn)態(tài)的維持以及抵抗外來病原微生物入侵等過程至關(guān)重要。

本研究首先通過構(gòu)建感受神經(jīng)特異性缺失Nav1.8DTA小鼠和痛覺感受神經(jīng)特異性DREADD小鼠，觀察到清除痛覺感受器之后，黏液層變薄，其腸道微生物構(gòu)成發(fā)生改變，即腸道菌群失調(diào)，而杯狀細(xì)胞是腸道內(nèi)一種特殊的上皮細(xì)胞，可以合成并分泌一種由黏蛋白和黏多糖組成的黏液，在腸道表面構(gòu)成一道保護(hù)屏障，因此推測痛覺感受神經(jīng)很可能通過調(diào)控杯狀細(xì)胞從而影響粘液層的厚度。為了探尋痛覺神經(jīng)調(diào)控杯狀細(xì)胞的機(jī)制，本研究對腸道上皮進(jìn)行了單細(xì)胞測序，并在各種獲得細(xì)胞類型中分析神經(jīng)肽受體（CGRP）的表達(dá)，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)CGRP的受體Ramp1在杯狀細(xì)胞中特異性高表達(dá)，表明痛覺感受神經(jīng)很可能通過分泌CGRP作用于杯狀細(xì)胞從而調(diào)控粘液層的厚度，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)飲食與微生物信號、機(jī)械壓力、化學(xué)刺激乃至溫度的突然變化都可以激活痛覺感受器，使得后者分泌CGRP，而CGRP通過RAMP1傳遞信號，進(jìn)而促使杯狀細(xì)胞分泌黏液，而特定的腸道微生物可以激活痛覺感受器分泌CGRP，從而有助于維持腸道穩(wěn)態(tài)。腸道粘黏液層的厚度也影響著腸道疾病的易感性。

本研究揭示了痛覺感受神經(jīng)在調(diào)控杯狀細(xì)胞粘液分泌過程中的功能及其分子機(jī)制，證明了其在維持腸道黏膜穩(wěn)態(tài)以及抵抗炎癥中的關(guān)鍵作用。此外，考慮到拮抗CGRP是臨床治療偏頭痛的常用治療手段，該研究提示了長期服用CGRP拮抗劑在腸道中可能帶來的副作用。同時，本研究也提供了靶向神經(jīng)、靶向神經(jīng)肽及其受體的以治療腸道炎癥的臨床治療思路。

 

02

多組學(xué)分析揭示了疤痕和再生傷口愈合過程中不同的分子事件

再生是組織修復(fù)的關(guān)鍵，但皮膚損傷通常會產(chǎn)生纖維化的、無功能的疤痕。開發(fā)促進(jìn)再生的療法需要嚴(yán)格了解從損傷到纖維化或再生的分子進(jìn)展。

在此，研究者在轉(zhuǎn)錄（單細(xì)胞RNA測序）、蛋白質(zhì)（TIMSTOF蛋白質(zhì)組學(xué)）和組織（細(xì)胞外基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)分析）水平上對瘢痕與YAP抑制誘導(dǎo)的傷口再生進(jìn)行分析。研究者選取了愈合過程中7個時間點(diǎn)做了分析。每只小鼠三分之一的組織用于組織學(xué)研究（超微結(jié)構(gòu)分析），其余進(jìn)行細(xì)胞分選，以分離成纖維細(xì)胞(Lin-)和其他細(xì)胞(主要是免疫細(xì)胞；Lin+)。一半細(xì)胞用于scRNA-seq分析，另外一半用于蛋白組學(xué)分析。每個樣本都用HTO標(biāo)記，使scRNA-seq分析的細(xì)胞和同一只老鼠的蛋白組學(xué)以及組化樣本相聯(lián)系。由于成纖維細(xì)胞是瘢痕形成過程中主要細(xì)胞類型，研究者對其進(jìn)行擬時序分析在細(xì)胞層面看再生修復(fù)軌跡，也對感興趣軌跡上基因做了分析；與GSEA分析結(jié)合，看傷口再生過程中關(guān)鍵基因；也做了SCENIC分析來比較基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的軌跡；細(xì)胞互作分析分析成纖維細(xì)胞相互作用情況；應(yīng)用CytoTRACE檢測再生細(xì)胞的分化程度。接下來分別分析了組成每個軌跡的簇，并檢查了每個分支上與CytoTRACE評分最相關(guān)的基因。通過多模式分析，研究者篩查出了4個關(guān)鍵基因。為了探測關(guān)鍵基因的空間分布，研究者對4個關(guān)鍵基因進(jìn)行了多重RNAscope原位雜交，他們也通過體內(nèi)基因敲除和在傷口中過表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，檢測結(jié)果顯示破壞YAP的機(jī)械傳導(dǎo)，可以通過激活Trps1和Wnt信號的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生再生修復(fù)。Trps1對于傷口再生是必要的，在早期和晚期愈合中具有獨(dú)特的作用，因此確定了Trps1在再生中的功能意義。

該研究的發(fā)現(xiàn)作為傷口再生的多組學(xué)圖譜，對病理性纖維化有治療性意義。

 

03

譜系追蹤和單細(xì)胞分析揭示Prom1+腫瘤增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征及其在肝癌進(jìn)展過程中的動態(tài)轉(zhuǎn)化

肝細(xì)胞癌（HCC）具有高度的腫瘤異質(zhì)性，先前研究發(fā)現(xiàn)Prominin-1(PROM1)/CD133是人HCC中重要的肝癌干細(xì)胞（CSC）標(biāo)記物。

本研究通過建立兩種小鼠HCC模型（包括慢性纖維化HCC和快速脂肪變性相關(guān)HCC），研究Prom1+細(xì)胞的在HCC中異質(zhì)性和特征。研究者在HCC模型建立后進(jìn)行了譜系追蹤，通過單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)來分析追蹤的Prom1+細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征。結(jié)果顯示，HCC腫瘤中的Prom1標(biāo)記了具有CSC樣特性的增殖性腫瘤增殖細(xì)胞，這些細(xì)胞在原發(fā)腫瘤中顯示原位克隆擴(kuò)增。而且這些標(biāo)記的Prom1+細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤性，以及形成不同譜系的癌癥的潛力。在兩種HCC模型中，低水平Prom1+細(xì)胞會抑制腫瘤生長并減少惡性腫瘤特征。同時，scRNA-seq分析強(qiáng)調(diào)了Prom1+HCC細(xì)胞的異質(zhì)性（遵循具有高增殖和干細(xì)胞特征的去分化狀態(tài)）。

總之，本研究通過結(jié)合體內(nèi)譜系追蹤和scRNA-seq，揭示了Prom1+HCC細(xì)胞的異質(zhì)性和動態(tài)轉(zhuǎn)化，為了解惡性CSC樣細(xì)胞在HCC進(jìn)展中的作用機(jī)制提供了新的見解。

 

04

單細(xì)胞RNA測序+空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)：揭示間質(zhì)性膀胱炎的免疫圖譜

為了研究間質(zhì)性膀胱炎（IC）中的免疫機(jī)制，研究者使用單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）對15名女性IC患者和9名應(yīng)激性尿失禁（對照組）患者的135,091個CD45+免疫細(xì)胞進(jìn)行測序。結(jié)果共鑒定出22個免疫亞群，其中，M2巨噬細(xì)胞、炎性CD14+巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞與其他免疫細(xì)胞的通信最多。并且在IC患者中，研究者發(fā)現(xiàn)記憶CD4+ T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，GZMK+CD8+ T細(xì)胞，記憶B細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等顯著增加，CD8+效應(yīng)T細(xì)胞，Th17細(xì)胞，濾泡輔助T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等顯著減少。富集分析確定了在細(xì)胞比例的動態(tài)變化過程中的病毒相關(guān)反應(yīng)。通過整合scRNA-seq結(jié)果與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，研究者發(fā)現(xiàn)幾乎所有免疫亞群都富集于尿路上皮區(qū)或IC膀胱成纖維細(xì)胞附近；但在對照組中，主要富集于膀胱的尿路上皮和平滑肌細(xì)胞周圍。

總之，這些發(fā)現(xiàn)描述了IC的免疫圖譜，并可能為IC的病理生理學(xué)提供有價值的見解。

 

05

空間組學(xué)研究新進(jìn)展--空間單細(xì)胞分辨率表觀遺傳修飾檢測

基因表達(dá)的時空調(diào)控對細(xì)胞和組織的發(fā)育和功能起著至關(guān)重要的作用，基于單細(xì)胞方法轉(zhuǎn)錄、蛋白及ATAC檢測導(dǎo)致細(xì)胞的空間背景丟失，雖然現(xiàn)在已經(jīng)有多種空間技術(shù)用于檢測空間水平的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)，但表觀遺傳特性的空間信息對于理解表觀基因組如何在復(fù)雜組織的原生環(huán)境中塑造細(xì)胞類型的發(fā)育和控制細(xì)胞狀態(tài)至關(guān)重要，最近的證據(jù)表明不同的增強(qiáng)子招募可能有助于在發(fā)育中的大腦產(chǎn)生精細(xì)劃定的區(qū)域，祖細(xì)胞在不同的大腦區(qū)域產(chǎn)生不同的神經(jīng)元，單細(xì)胞ATAC研究也表明來自不同染色質(zhì)可達(dá)性和表觀遺傳修飾譜，但這些信息在空間分布仍不清楚。

本研究基于FISH基本原理開發(fā)了一種單細(xì)胞空間分辨表觀基因組譜的方法，使用原位標(biāo)記和轉(zhuǎn)錄，然后是多重成像，展示了在單個細(xì)胞中標(biāo)記活性啟動子、推定增強(qiáng)子和沉默啟動子的組蛋白修飾的能力，該方法突破了成像方法對于短序列檢測的難度，展示了成像基因組位點(diǎn)的能力，短至幾百個堿基，識別它們的表觀遺傳狀態(tài)，并繪制它們的空間分布。該研究使用這一方法生成了胚胎和成年小鼠大腦中數(shù)百個活性啟動子和推定增強(qiáng)子的高分辨率空間圖譜，表明了假定的啟動子-增強(qiáng)子對和增強(qiáng)子樞紐調(diào)節(jié)發(fā)育重要基因。

總之，該方法將普遍適用于表觀遺傳修飾和DNA結(jié)合蛋白的空間分析，將促進(jìn)我們對基因表達(dá)如何受表觀基因組時空調(diào)節(jié)的理解。

 

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