多組學(xué)分析揭示疤痕和再生傷口愈合過(guò)程中不同的分子事件（一）

多組學(xué)分析揭示疤痕和再生傷口——愈合過(guò)程中不同的分子事件

再生是組織修復(fù)的關(guān)鍵，但皮膚損傷通常會(huì)產(chǎn)生纖維化的、無(wú)功能的疤痕。開發(fā)促進(jìn)再生的療法需要嚴(yán)格了解從損傷到纖維化或再生的分子進(jìn)展。在此，研究者在轉(zhuǎn)錄（單細(xì)胞RNA測(cè)序）、蛋白質(zhì)（TIMSTOF蛋白質(zhì)組學(xué)）和組織（細(xì)胞外基質(zhì)超微結(jié)構(gòu)分析）水平上對(duì)瘢痕與YAP抑制誘導(dǎo)的傷口再生進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，破壞YAP的機(jī)械傳導(dǎo)，可以通過(guò)激活Trps1和Wnt信號(hào)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生再生修復(fù)。他們也通過(guò)體內(nèi)基因敲除和在傷口中過(guò)表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，確定Trps1是一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因。該研究的發(fā)現(xiàn)作為傷口再生的多組學(xué)圖譜，對(duì)病理性纖維化有治療性意義。

 

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文章詳情

文章題目：Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing

中文題目：多組學(xué)分析揭示了疤痕和再生傷口愈合過(guò)程中不同的分子事件

見刊時(shí)間：2022.02

期刊名稱：Cell Stem Cell

影響因子：25.269

實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：scRNA-seq (10X Genomics)、蛋白質(zhì)組學(xué)（TIMSTOF）

DOI：10.1016/j.stem.2021.12.011

 

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研究?jī)?nèi)容

1、纖維性和再生性傷口的多模式分析

由于損傷修復(fù)包括多個(gè)階段，因此隨著時(shí)間的推移，研究愈合的細(xì)胞和分子動(dòng)力學(xué)是至關(guān)重要的。研究者在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析了小鼠傷口和小鼠皮膚：UW皮膚，術(shù)后第一天(POD) 2(炎癥)，POD 7(成纖維細(xì)胞增殖)，POD 10，POD 14(傷口重新上皮化，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM)，POD 21和POD 30(成纖維細(xì)胞重塑ECM)。研究者使用了夾板切除傷口模型，從而誘導(dǎo)類似人類的愈合動(dòng)力學(xué)。傷后立即在創(chuàng)面上注射維替泊芬或載藥(磷酸鹽緩沖生理鹽水[PBS])對(duì)照。對(duì)照組創(chuàng)面形成明顯的纖維疤痕，基本上是裸露的區(qū)域，有致密的、線性排列的ECM纖維，沒有次生元素(HF，腺體)；相反，到POD 30時(shí)，維他泊芬處理的傷口再生的HF和腺體水平與UW皮膚相當(dāng)，并有更低密度、更隨機(jī)定向的ECM纖維(圖1A)。證實(shí)再生不反映維替泊芬的脫靶效應(yīng)，通過(guò)En-1成纖維細(xì)胞系靶向YAP敲除觀察到類似的表型。

為了研究再生和纖維化傷口的細(xì)胞和分子動(dòng)力學(xué)，研究者從5個(gè)關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)(UW、POD 2、7、14和30)分別損傷并分析5只小鼠(2個(gè)傷口池/只老鼠)和治療條件(對(duì)照組，維替泊芬;圖1 B)。每只小鼠三分之一的組織用于組織學(xué)檢查，其余進(jìn)行細(xì)胞分類，以分離成纖維細(xì)胞(Lin−)和其他細(xì)胞(主要是免疫細(xì)胞;Lin+)。一半的細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析:從每只小鼠的Lin -和Lin+細(xì)胞中純化的多肽進(jìn)行timsTOF質(zhì)譜。其余細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，每個(gè)樣本都帶有標(biāo)簽寡核苷酸(HTO)，使scRNA-seq細(xì)胞與來(lái)自同一只小鼠的蛋白質(zhì)組學(xué)和組織學(xué)樣本相連接。

研究者通過(guò)scRNA-seq共分析了2,986個(gè)細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了聚類 (圖1C)。結(jié)果顯示，維替泊芬治療的傷口成纖維細(xì)胞適度增加，但對(duì)照組和維替泊芬傷口的細(xì)胞比例大體相似(圖1D)，這表明維替泊芬可能通過(guò)改變細(xì)胞表型而不是相對(duì)表現(xiàn)(或通過(guò)改變細(xì)胞類型中亞群的表現(xiàn))來(lái)誘導(dǎo)再生。隨后研究者做了timsTOF 4D蛋白組學(xué)分析 (圖1E)，并表明蛋白組分析可以在更廣泛的修復(fù)動(dòng)態(tài)中捕獲連貫的纖維化變化。最后，由于ECM結(jié)構(gòu)/組織是物理組織特性的關(guān)鍵決定因素，他們使用新開發(fā)的圖像處理算法對(duì)損傷皮膚和UW皮膚的ECM超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行了量化(圖1F上)。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，對(duì)照傷口的ECM與UW的ECM顯著不同(圖1F左下)，證明了纖維化瘢痕。相比之下，POD 14/30維替泊芬傷口與UW皮膚重疊(圖1F，右下)，表明維替泊芬治療后的愈合產(chǎn)生了UW樣ECM。無(wú)論是哪種處理，POD 7-14之間的差異最大，這與ECM沉積主要發(fā)生在這段時(shí)間一致。

圖1. 瘢痕和再生傷口修復(fù)的多模式分析

 

2、識(shí)別修復(fù)的分子軌跡

在建立了通過(guò)scRNA-seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和ECM超微結(jié)構(gòu)分析分析傷口動(dòng)力學(xué)的能力后，研究者試圖應(yīng)用這些方法來(lái)確定再生和纖維化的不同機(jī)制。由于成纖維細(xì)胞是高度機(jī)械敏感性的，也是瘢痕形成的主要驅(qū)動(dòng)因素，他們假設(shè)維替泊芬通過(guò)改變成纖維細(xì)胞表型來(lái)促進(jìn)再生，并將scRNA-seq分析聚焦于成纖維細(xì)胞。他們做了細(xì)胞軌跡分析 (圖2A)。由此產(chǎn)生的軌跡有兩個(gè)分叉的分支，早期(POD 2)損傷的成纖維細(xì)胞靠近分支點(diǎn)，晚期損傷的成纖維細(xì)胞位于分支末端(圖2B第一張圖)，UW皮膚成纖維細(xì)胞幾乎只存在于底部分支(圖2B第二組)。他們假設(shè)下臂代表了再生修復(fù)軌跡，成纖維細(xì)胞向UW樣狀態(tài)進(jìn)展，而上臂(富含PBS/缺乏UW皮膚成纖維細(xì)胞)是一個(gè)相對(duì)纖維化的軌跡。值得注意的是，在再生臂中發(fā)現(xiàn)了一些PBS創(chuàng)面成纖維細(xì)胞(圖2B第二組)，突出說(shuō)明再生和纖維化可能在細(xì)胞上并不相互排斥;具有促再生活性的細(xì)胞可能存在于疤痕傷口中，但在缺乏干預(yù)(例如，YAP抑制)的情況下，促纖維化分子編程可能會(huì)覆蓋這一點(diǎn)，并導(dǎo)致主要的疤痕表型。

接下來(lái),他們?cè)噲D識(shí)別出可再生成纖維細(xì)胞和再生成纖維細(xì)胞軌跡的明顯特征。louvainbase(Seurat)聚類識(shí)別出6個(gè)成纖維細(xì)胞集群：集群0和4組成“再生”臂；1、2、5組成“纖維性”臂；3個(gè)主要包括UW皮膚成纖維細(xì)胞(圖2B最后一個(gè)面板和3A)。研究者沿著感興趣的主要軌跡計(jì)算每個(gè)基因的擬時(shí)序皮爾森相關(guān)性(圖2B第三組)。纖維化臂(簇1、2和5)富含已知的促纖維化標(biāo)志物，如Dpp4、Fap和Gpx3(圖2C和3B)。纖維細(xì)胞型軌跡細(xì)胞也表達(dá)了更多的Fgf2、Il6、Ccl2、Myc和Tead1，其在成纖維細(xì)胞中的上調(diào)且與焦粘附激酶(FAK)-介導(dǎo)的器官纖維化和腫瘤基質(zhì)沉積有關(guān)。GSEA分析顯示在基因的前1%與擬時(shí)序呈正相關(guān),揭示了ECM沉積,生長(zhǎng)因子，機(jī)械化以及與纖維相關(guān)的應(yīng)激物(MAPK)/ Ras信號(hào)和焦點(diǎn)粘附(圖2D和3D)，支持經(jīng)典的親纖維性表型。

他們接下來(lái)研究了與擬時(shí)序強(qiáng)負(fù)相關(guān)的基因，并發(fā)現(xiàn)了多種發(fā)展- /再生相關(guān)的基因(圖2F和3C),包括Bmp4類似的與再生損傷反應(yīng)有關(guān)的基因。他們還確定了幾個(gè)參與Wnt信號(hào)的基因，包括Wnt靶標(biāo)Axin2和Twist1；Wnt通路調(diào)控因子Trps1，其與HF形態(tài)發(fā)生有關(guān)。通過(guò)對(duì)與擬時(shí)序負(fù)相關(guān)的前1%基因進(jìn)行GSEA分析，再生臂的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)和Wnt相關(guān)條目富集；被富集到的條目也包括多個(gè)與Wnt相關(guān)的條目和“調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性的信號(hào)通路”(圖2G和3E)。接下來(lái)，他們使用SCENIC平臺(tái)比較基于基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的軌跡 (圖2I)。Trps1、Gli1和Twist1調(diào)控子在再生臂中被更多激活(圖2J)，進(jìn)一步支持Wnt激活。他們還做了基于CellChat方法的細(xì)胞互作分析 (圖4A和4B)。CellChat強(qiáng)調(diào)了增強(qiáng)的促炎癥信號(hào)(例如:,CXCL和IL6)在再生臂中涉及瘢痕(PBS)成纖維細(xì)胞和非標(biāo)準(zhǔn)Wnt信號(hào)(圖4C-4E)。

接下來(lái)，他們又做了RNA速率分析。結(jié)果顯示，纖維化臂和再生臂的RNA速率方向相反，纖維化臂中的載體指向增加的POD，而再生臂中的載體指向更早的時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞(圖2K)。他們還應(yīng)用了CytoTRACE。結(jié)果顯示，UW皮膚成纖維細(xì)胞分化程度最高(CytoTRACE評(píng)分較低)，而傷口成纖維細(xì)胞分化程度相對(duì)較低(評(píng)分較高;圖2 L)。纖維臂成纖維細(xì)胞總體上分化較少，隨著POD的增加分化增加(分?jǐn)?shù)降低)，而再生臂細(xì)胞沿軌跡分化減少，表明隨著愈合的進(jìn)展，發(fā)育潛力增加。接下來(lái)，他們分別分析了組成每個(gè)軌跡的聚類，并檢測(cè)了與每個(gè)分支的CytoTRACE評(píng)分最相關(guān)的基因。在纖維力臂中，隨著時(shí)間的推移，分?jǐn)?shù)的減少很大程度上是由與ECM相關(guān)的基因(圖3F上)驅(qū)動(dòng)的,與成熟的瘢痕成纖維細(xì)胞的命運(yùn)相一致。另一方面，在再生臂中隨著時(shí)間的推移，在再生臂上的分?jǐn)?shù)增加(圖3F下)，與HF和ECM再生一致，在治療后最突出(POD 14/30，圖1)�？偟膩�(lái)說(shuō)，CytoTRACE在RNA速度分析上支持相反的細(xì)胞軌跡，并獨(dú)立支持纖維化與再生臂表型。

 

3、多模態(tài)數(shù)據(jù)集成分析傷口修復(fù)軌跡

為了跨平臺(tái)分析，他們首先嘗試將成纖維細(xì)胞(Lin−)蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與scRNA-seq數(shù)據(jù)廣泛關(guān)聯(lián)起來(lái)。纖維臂中富集的蛋白質(zhì)的GSEA顯示了與生長(zhǎng)因子信號(hào)、機(jī)械信號(hào)、收縮性和ECM沉積/組織和ECM成分(膠原、腓纖維蛋白[Fbln1]和纖維連接蛋白[Fn1]；圖2 E) 強(qiáng)相關(guān)的條目富集。相比之下，再生臂缺乏機(jī)械信號(hào)、收縮力或ECM相關(guān)條目，與scRNA-seq一致(圖2H)。接下來(lái)，他們將scRNA-seq數(shù)據(jù)與ECM結(jié)構(gòu)和HF/gland計(jì)數(shù)的變化相關(guān)聯(lián)結(jié)果顯示，簇5細(xì)胞高表達(dá)Dpp4、Il6和Ccl2，是瘢痕成纖維細(xì)胞的特征(圖3B)。

 

圖2. 擬時(shí)序內(nèi)成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組軌跡分析
圖3. 瘢痕和再生過(guò)程中成纖維細(xì)胞的擬時(shí)序和CytoTRACE分析 圖4. CellChat分析成纖維細(xì)胞相互作用

 

研究者在進(jìn)行多模式分析之后確定了Trps1在再生中的功能意義，但具體如何確定的呢？請(qǐng)見下回詳解……