NIR-II 超亮熒光及超高光熱轉(zhuǎn)換大 π 共軛單分子探針用于光熱診療

本文要點：第二近紅外（NIR-II，1000-1700 nm）窗口熒光成像引導(dǎo)的光熱治療探針有望用于精確的癌癥光治療診斷學(xué)。然而，目前報道的大多數(shù)探針在單個分子中沒有表現(xiàn)出高NIR-II熒光亮度（摩爾吸收系數(shù)（ε）×量子產(chǎn)率（QY））和光熱性能（ε×光熱轉(zhuǎn)換效率（PCE））。本文報道了一種解決這一挑戰(zhàn)的通用策略，即通過制備具有剛性分子骨架和柔性側(cè)基的大π偶聯(lián)分子（BNDI-Me）。所提出的BNDI-Me納米探針提高了ε，同時優(yōu)化了其QY和PCE。因此，高NIR-II熒光亮度（ε × QY = 2296 m−1厘米−1）和強光熱性能（ε×PCE = 82 000）成功地?fù)饺雴蝹�小分子中，并且這兩個參數(shù)中的任何一個都優(yōu)于目前最好的熒光或光熱探針。因此，在全身低注射劑量下獲得了優(yōu)越的體內(nèi)NIR-II成像效果和高光熱腫瘤抑制率（81.2%）。
 

 

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背景：在單個探針中集成高分辨率的近紅外二區(qū)（NIR-II，1.0-1.7μm）熒光成像和時空可控的發(fā)熱，特別是生物相容性和易于重復(fù)的有機小分子，為非侵入性和精確的光治療診斷學(xué)方面提供巨大的潛力。目前的NIR-II熒光基團設(shè)計策略側(cè)重于通過結(jié)合電子供體（D）和受體（A）單元來創(chuàng)建強大的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）分子骨架。通常，由共價單鍵連接的D/A亞基天然喜歡靈活的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，這不僅有利于π系統(tǒng)較差的軌道重疊，導(dǎo)致低ε，而且在強極性水生物環(huán)境中將柔性骨架驅(qū)動到扭曲的ICT狀態(tài)，以促進(jìn)激發(fā)態(tài)的非輻射衰變，導(dǎo)致相對較低的QY和高的PCE。目前流行的改善QY的策略包括將具有立體旋轉(zhuǎn)阻礙的D與分子骨架結(jié)合，以減少靈活的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)。這可能會將QY從1%提高到10%以上，同時將ε從104降低至 ≈103 m−1厘米−1，熒光亮度僅略有提高。本文通過制造具有剛性分子骨架和柔性側(cè)基的大π偶聯(lián)小分子（BNDI-Me）將高NIR-II熒光亮度和光熱性能結(jié)合到單個分子中（方案1）。

方案1

 

研究內(nèi)容：

 

1、 分子設(shè)計與合成

BNDI-H和BNDI-Me的分子設(shè)計如方案1所示。之所以選擇NDI，是因為它具有剛性的大π偶聯(lián)分子骨架，沒有強烈的ICT效應(yīng)。新的大π偶聯(lián)分子（BNDI-H）具有新設(shè)計：它是通過加寬NDI染料的共軛骨架合成的。BNDI-H發(fā)射出現(xiàn)在NIR-II窗口中，因為它具有較大的π共軛效應(yīng)，而不是強烈的ICT效應(yīng)。其分子骨架剛性且共軛，沒有強烈的ICT效應(yīng)，有利于激發(fā)態(tài)的輻射衰變，以確保分子水平上的高QY。然而，剛性和共軛分子骨架傾向于形成平面分子，導(dǎo)致聚集狀態(tài)下強烈的分子間π-π相互作用，這導(dǎo)致嚴(yán)重的ACQ，QY顯著降低，水中PCE高。為了克服這個問題，在BNDI-H中間插入了兩個靈活的側(cè)基（甲基）作為空間位阻基和運動亞基。作為空間位阻基團，這些甲基扭曲BNDI-H的平面以增加分子間空間并減少聚集，從而提高NIR-II熒光QY，但降低PCE。此外，作為運動亞基，這些甲基的運動有助于發(fā)熱，從而抵消了由于聚集減少而導(dǎo)致的熱量減少。因此，兩個靈活的側(cè)基優(yōu)化了BNDI-Me NP的QY和PCE，以同時獲得可觀的QY和PCE。此外，BNDI-Me的剛性和共軛分子骨架確保了π系統(tǒng)豐富的軌道重疊，從而產(chǎn)生了高ε。最終，BNDI-Me獲得了高ε，同時優(yōu)化了水中的QY和PCE，在單個分子中結(jié)合了高NIR-II熒光亮度和強大的光熱效應(yīng)。

 

2、 光學(xué)特性

為了獲得良好的水分散性和生物相容性，疏水性BNDI-H和BNDI-Me與兩親性聚合物F-127共沉淀，制備了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs。通過動態(tài)光散射（DLS）測量，發(fā)現(xiàn)BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的平均流體動力學(xué)直徑分別為≈54和46 nm（圖1a，b）。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的透射電子顯微鏡（TEM）圖像表現(xiàn)出良好的均勻球形貌（圖1a，b插圖）。為了驗證BNDI-H和BNDI-Me沒有強ICT效應(yīng)，首先對不同溶劑極性的BNDI-H和BNDI-Me進(jìn)行了經(jīng)典的溶劑變色效應(yīng)測試。如圖1c-f所示，BNDI-H和BNDI-Me表現(xiàn)出預(yù)期的NIR-I吸收峰和NIR-II發(fā)射。隨著溶劑極性從甲苯增加到二甲基甲酰胺，BNDI-H（圖1d）和BNDI-Me（圖1f）的熒光峰僅略有變化。更重要的是，當(dāng)溶劑極性增加時，它們的熒光峰表現(xiàn)出隨機變化而不是漸進(jìn)式紅移（圖1g）。這與溶劑極性增加時強ICT分子的熒光峰逐漸向長波長偏移的現(xiàn)象相矛盾。此外，斯托克斯位移（ν̃abs–ν̃em）和溶劑極性參數(shù)（∆f）擬合，以根據(jù)Lippert-Mataga方程評估深色位移特征。如圖1h所示，BNDI-H和BNDI-Me的∆f和斯托克斯位移線性關(guān)系的斜率分別為665和595 cm-1，這顯著低于所報告的強ICT分子的值。這些光譜特征表明，BNDI-H和BNDI-Me都沒有表現(xiàn)出強烈的ICT效應(yīng)。因此，BNDI-H和BNDI-Me是基于大π共軛而不是強烈的ICT效應(yīng)實現(xiàn)NIR-II發(fā)射。這可以克服強ICT分子的原生限制。其次，研究了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的光學(xué)性質(zhì)。如圖1i所示，兩種NP均顯示出廣泛的吸收，范圍從600到1200nm。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs分別在≈873和859 nm處表現(xiàn)出主要吸收峰，肩峰分別在991和944 nm處出現(xiàn)。BNDI-H NP在其主要吸收峰處的ε值被確定為1.34×105和BNDI-Me NP為1.64 × 105m−1∙厘米−1（圖1j），比在水中的強ICT分子高一兩個數(shù)量級（≈103–104m−1∙厘米−1）和花青（≈104m−1∙厘米−1），從而反映了大多環(huán)π共軛分子在光吸收能力方面的優(yōu)勢。此外，盡管它們在808 nm處的吸收（治療診斷學(xué)常用的激發(fā)波長）明顯弱于其主峰吸收（圖1i），但ε仍然高達(dá)6.48×104和8.83 × 104m−1∙厘米−1分別為BNDI-H NP和BNDI-Me NP（圖1j）。在808 nm激光激發(fā)下，在水溶液中分別觀察到BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的發(fā)射峰（圖1k）。BNDI-H NPs的熒光強度明顯弱于摩爾濃度相同的BNDI-Me NPs，這與它們的NIR-II熒光圖像一致（圖1k插圖）。此外，還評估了他們的NIR-II熒光QY。BNDI-Me NPs（2296）的ε×QY值是BNDI-H NPs（80.4）的≈28.6倍，明顯高于先前報道的大多數(shù)具有高熒光亮度的NIR-II熒光團（圖1m）。與美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)的吲哚菁綠（ICG）中的嚴(yán)重光漂白相比（圖1l），BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的熒光強度在連續(xù)808 nm（1 W cm）下表現(xiàn)出可忽略不計的衰減−2）照射30分鐘，從而表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。

圖1

 

3、 光熱性質(zhì)

研究兩種NPs的光熱特性，使用臨床批準(zhǔn)的ICG作為對照。如圖2a，b所示，當(dāng)NPs和ICG以相同濃度存在時，發(fā)現(xiàn)ICG的溶液溫度為40℃，由于其光穩(wěn)定性差，激光照射4分鐘后開始降低（圖2a頂部）。即使?jié)舛燃颖�，ICG的溶液溫度在6分鐘時也只能達(dá)到49℃，然后降低（圖2a下）。相比之下，兩種NPs的溶液溫度持續(xù)升高（圖2b），最高溫度明顯高于ICG。這表明兩種NP在光熱療法（PTT）方面均優(yōu)于ICG。此外，在808 nm激光照射下測試了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的濃度和激光功率密度相關(guān)的溫度變化曲線。在808 nm激光（1Wcm−2，10分鐘），當(dāng)探針濃度從2.50×10−6增加至 2.50 × 10−5M時，BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的所有溶液溫度（圖2c，d）逐漸升高。在2.50 × 10−5M 時BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的最高溫度分別為64.1和68℃。在對照實驗中，純水在808nm激光照射下的溫度升高1.8℃（圖2c，d）。此外，濃度為2.50×10−5M時在0.25至1 W cm-2的不同激光功率下研究了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的溫度變化（圖2e，f）。兩種NP的溶液溫度隨激光功率密度的增加而迅速升高。這些結(jié)果明確地證實了BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs是有效的光熱劑。根據(jù)先前報道的方法，在808 nm激光照射下，BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的PCE分別為52%和50%（圖2g，h）。BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的4次加熱/冷卻循環(huán)表明它們具有良好的光熱能力（圖2i，j）。兩種NPs的光熱性能幾乎沒有衰減，證實了其優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。吸收光譜和溶液顏色的變化可以忽略不計。最后，基于ε×PCE進(jìn)一步評價了兩種NPs的光熱性能。分別計算出BNDI-H NP和BNDI-Me NP在其最大吸收波長下的ε×PCE值為6.97×104和8.20×104。更重要的是，BNDI-Me NPs的值明顯高于先前報道的最佳有機光熱探針（圖2k），表明BNDI-Me NPs表現(xiàn)出更好的光熱性能。

圖2

 

4、 結(jié)合高熒光亮度和光熱性能的可能光物理機制

與傳統(tǒng)的以犧牲光熱性能為代價提高熒光亮度的策略不同，上述實驗數(shù)據(jù)表明，BNDI-Me NPs在保持可觀PCE的同時提高了QY。為了證明可能的機制，我們首先對BNDI-H和BNDI-Me的電子云分布進(jìn)行了密度泛函理論（DFT）計算（圖3a）。如圖3a所示，BNDI-H和BNDI-Me的最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）幾乎均勻地沿著共軛骨架離域，但它們不是主要位于局部單元上。它還證實BNDI-H和BNDI-Me沒有強烈的ICT效應(yīng)，與經(jīng)典的溶劑變色效應(yīng)測試一致（圖1c-h）。BNDI-H的HOMO、LUMO和帶隙分別為−5.04、−3.50和1.54 eV。然而，與BNDI-H相比，BNDI-Me表現(xiàn)出較低的HOMO（-5.11 eV），較高的LUMO和更高的帶隙（1.73 eV），這是BNDI-Me吸收光譜中藍(lán)移的特征，與光譜數(shù)據(jù)一致（圖1c，e）。為了確認(rèn)兩個柔性甲基作為空間位阻基團形成非平面BNDI-Me，進(jìn)一步計算了分子的優(yōu)化基態(tài)幾何形狀。BNDI-H在NDI單元與其核心之間表現(xiàn)出3.2°和3.1°的小二面角（圖3a（向下））。然而，BNDI-Me表現(xiàn)出更大的二面角，分別為24.5°和29.9°，表明BNDI-Me表現(xiàn)出非平面構(gòu)象。因此，這些數(shù)據(jù)表明，兩個甲基作為空間位阻在BNDI-Me中引起了非平面構(gòu)象。這些數(shù)據(jù)表明，兩個柔性甲基作為空間位阻形成非平面BNDI-Me可以有效增加納米顆粒中的分子間空間，從而比平面BNDI-H減弱ACQ效應(yīng)，提高BNDI-Me NPs的質(zhì)量。為了進(jìn)一步了解BNDI-H NPs和BNDI-Me NPs的輻射和非輻射特性，通過飛秒瞬態(tài)吸收（fs-TA）光譜測量研究了兩種NPs的激發(fā)態(tài)動力學(xué)。根據(jù)穩(wěn)態(tài)吸收光譜（圖1i）和病后雙熱診斷應(yīng)用，我們使用800 nm脈沖激光器作為激發(fā)激光器來研究兩種NPs的fs-TA光譜。通常，基態(tài)漂白（GSB）和受激發(fā)射（SE）通常表現(xiàn)出負(fù)面信號。激發(fā)態(tài)吸收（ESA）通常表現(xiàn)出正信號。根據(jù)穩(wěn)態(tài)吸收光譜（圖1i），應(yīng)將突出的負(fù)信號分配給GSB（圖3c，d）。為了進(jìn)一步獲得更多細(xì)節(jié)，分別從圖3c，d中提取了兩個NPs在選定衰變時間的fs-TA光譜（圖3e，f）。隨著延遲時間的增加，GSB和ESA信號均逐漸減小，BNDI-H NPs的衰變基本在65 ps以內(nèi)結(jié)束，BNDI-Me NPs的衰變在200 ps以內(nèi)結(jié)束，排除了其他新物種的出現(xiàn)（圖3e，f）。BNDI-H NP在868 nm處的GSB衰減過程和BNDI-Me NP在854 nm處的GSB衰變過程如圖3g所示，BNDI-H NPs的非輻射衰變通道顯示出相當(dāng)短的壽命，為1.23 ps（τ1）和13.4 ps（τ2）的激發(fā)群體，相應(yīng)振幅為28.8%（A1）和71.2%（A2）。對于BNDI-Me NP，非輻射衰變通道耗散的壽命相當(dāng)短，為2.97 ps（τ1）和 48.7 ps（τ2）的激發(fā)群體，相應(yīng)振幅為45.4%（A1）和 54.6%（A2）。

圖3

 

5、 NIR-II 體內(nèi)熒光成像

BNDI-Me NPs表現(xiàn)出極高的NIR-II熒光亮度，在低全身注射劑量下提高熒光成像質(zhì)量具有巨大潛力。為了評估BNDI-Me NPs在體內(nèi)的NIR-II熒光成像性能，我們首先研究了BNDI-Me NPs的潛在毒性。PBS和BNDI-Me NPs（100 μL，0.5 mg mL−1）靜脈注射到健康小鼠中。然后處死小鼠，并在注射后1，21天提取主要器官進(jìn)行蘇木精和伊紅（H&E）染色。與PBS處理的小鼠相比，兩組小鼠在主要器官中未觀察到明顯差異，表明BNDI-Me NPs未引起主要器官的明顯組織學(xué)異常或病變。因此，BNDI-Me NPs具有良好的生物相容性，適用于體內(nèi)成像。在注射BNDI-Me NPs后5分鐘對全身進(jìn)行NIR-II熒光成像（圖4a）。同時，后肢脈管系統(tǒng)的血管表現(xiàn)出高信噪比（SBR = 3.54和3.50）和半峰時短全寬（FWHM = 0.398和0.369 mm），顯示出高空間分辨率成像特征（圖4b，c）。此外，即使在注射BNDI-Me NPs后11小時，后肢脈管系統(tǒng)仍然清晰可見，從而實現(xiàn)了動態(tài)脈管系統(tǒng)的長期觀察。此外，由于BNDI-Me NPs通過增強的通透性和保留效應(yīng)被動靶向，腫瘤區(qū)域的NIR-II熒光信號隨著時間的推移逐漸增加，并且在注射BNDI-Me NPs后≈48 h觀察到腫瘤中腫瘤與正常組織（T/NT）比值≈8.7的最大積累（圖4d，此外，即使在體內(nèi)也可以清楚地觀察到肝臟和脾臟的形狀（圖4d），因為高熒光亮度增加了組織的成像深度和分辨率比，表明BNDI-Me NPs的高質(zhì)量成像能力。隨后，處死4T1荷瘤小鼠;在肝脾中觀察到強烈的NIR-II熒光信號，在肺、心臟和腎臟中觀察到相對較差的NIR-II熒光信號，表明肝膽系統(tǒng)是BNDI-Me NPs的清除路徑（圖4f，g）。這些結(jié)果表明，即使在低全身注射劑量下，BNDI-Me NPs作為NIR-II熒光造影劑在腫瘤診斷中也有潛力。

圖4

 

6、 腫瘤的光熱性質(zhì)

為了評價BNDI-Me NPs在體內(nèi)的光熱性能，首先在細(xì)胞水平上分析了它們的光毒性和暗毒性。應(yīng)用3-（4，5-二甲基-2-噻唑基）-2，5-二苯基-2-H-四唑溴化物（MTT）測定來研究BNDI-Me NPs在Hela和4T1癌細(xì)胞中的潛在細(xì)胞毒性和PTT作用（圖5a）。在沒有激光照射的情況下觀察到高細(xì)胞活力，表明它們具有出色的生物相容性。相反，隨著BNDI-Me NPs濃度的增加，BNDI-Me NP處理的Hela和4T1細(xì)胞在808 nm激光照射10分鐘（0.3 W cm−2）下存活率降低。它們的生存能力分別下降到16.1%和13.9%，濃度為2.0×10−5M。此外，還進(jìn)行了活細(xì)胞和死細(xì)胞染色測試，通過使用鈣黃綠素-乙酰氧基甲基（鈣黃綠素-AM）和碘化丙啶（PI）共染色來區(qū)分活細(xì)胞（綠色熒光）和死細(xì)胞（紅色熒光）。如圖5b所示，對照組中幾乎所有細(xì)胞都被綠色熒光染色。然而，在用808nm激光處理的實驗組中，大多數(shù)細(xì)胞被紅色熒光染色，這表明這些是死細(xì)胞。進(jìn)一步評估了BNDI-Me NPs在腫瘤組織中的PTT作用。接種異種移植4T1腫瘤的小鼠（n=5）分為以下四組：對照組（僅用PBS，BNDI-Me NPs（100μL，0.5mg mL−1），或 PBS + 808 nm 激光照射 （0.3 W cm−2））和實驗組（BNDI-Me NPs（100 μL，0.5 mg mL−1） + 808 nm 激光照射 （0.3 W cm−2)).BNDI-MeNPs（100 μL， 0.5 mg mL−1）通過尾靜脈注射到4T1荷瘤小鼠中。根據(jù)腫瘤NIR-II成像過程中獲得的BNDI-Me NPs的最大積累時間，我們進(jìn)行了808 nm（0.3 W cm−2）的PTT激光照射在注射BNDI-Me NPs后48小時照射腫瘤部位。記錄照射過程中腫瘤區(qū)域的溫度變化和熱成像（圖5c）。BNDI-Me NPs + 808 nm組表現(xiàn)出快速的溫度生長，在10 min內(nèi)升至62.2 °C，可以強力殺死癌細(xì)胞（圖5d）。相比之下，PBS + 808 nm組在激光照射下僅表現(xiàn)出輕微的溫度升高，最高溫度為36.9 °C，這進(jìn)一步證明了BNDI-Me NPs的有效PTT效應(yīng)。在接下來的14天PTT期間，每2天記錄一次所有組小鼠的腫瘤體積和體重。我們觀察到，隨著時間的流逝，實驗組的腫瘤體積明顯減少，對照組的腫瘤體積穩(wěn)步快速增長。這表明BNDI-Me NP誘導(dǎo)的PTT可以有效抑制腫瘤（圖5e）。PTT治療14天后，切除主要器官和腫瘤組織。BNDI-Me NPs+808 nm組的腫瘤抑制率（81.2%）明顯高于其他組（圖5f，g），從而證明了BNDI-Me NPs的高抗腫瘤作用。緊接著，通過蘇木精-伊紅（H&E）染色和末端轉(zhuǎn)移酶UTP切口末端標(biāo)記（TUNEL）測定研究了所有組的細(xì)胞狀態(tài)和腫瘤凋亡；實驗組的腫瘤細(xì)胞比對照組的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更高的死亡和凋亡率（圖5h）。

圖5

 

總結(jié)：本文通過制造具有剛性骨架和柔性側(cè)基的大π偶聯(lián)分子，在低全身注射劑量下將強大的NIR-II熒光亮度和光熱性能結(jié)合到單個小分子（BNDI-Me）中。該策略在優(yōu)化QY和PCE的同時提高了光吸收，這有助于在單個分子中結(jié)合高NIR-II熒光亮度和強光熱效應(yīng)，這兩者都明顯優(yōu)于以前的研究。

 

參考文獻(xiàn)

Li, Y.; Tang, Y.; Hu, W.; Wang, Z.; Li, X.; Lu, X.; Chen, S.; Huang, W.; Fan, Q., Incorporation of Robust NIR-II Fluorescence Brightness and Photothermal Performance in a Single Large pi-Conjugated Molecule for Phototheranostics. Adv Sci (Weinh) 2023, 10 (3), e2204695.

 

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