單細(xì)胞測序在對非小細(xì)胞肺癌微環(huán)境于免疫治療中動態(tài)變化研究的應(yīng)用
抗PD-(L)1免疫檢查點(diǎn)抑制治療已成為晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的一線治療方案。對于早期可切除NSCLC，近年來新輔助免疫治療的方案顯示出良好的治療前景。然而，仍然只有約40%的早期NSCLC在新輔助免疫治療后達(dá)到主要病理緩解（major pathologic response，MPR），大部分患者依舊對治療抵抗【1】。腫瘤微環(huán)境（Tumor microenvironment，TME）對于腫瘤治療耐藥有重要作用，而治療本身又可重塑TME。解析免疫治療和TME的相互作用可能是解決NSCLC免疫治療抵抗的關(guān)鍵突破口。盡管免疫治療在晚期NSCLC已實踐多年，但是關(guān)于免疫治療對肺癌TME作用的研究仍然很缺乏。
近日，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬課題組與同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王晨飛課題組與合作，于Genome Medicine 雜志在線發(fā)表題為Tumor Microenvironment Remodeling after Neoadjuvant Immunotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing的研究論文。該研究利用單細(xì)胞及大量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell and bulk RNA-seq）、非靶向代謝組學(xué)以及多色熒光染色系統(tǒng)刻畫NSCLC的TME在新輔助免疫治療中的動態(tài)變化，鑒定出新的生物標(biāo)志物以及潛在的耐藥的新機(jī)制。
接著研究人員進(jìn)一步分析各個免疫細(xì)胞亞群的動態(tài)變化。對比TN組，MPR和NMPR組的CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞均被激活，但是MPR組的殺傷性CD8+ T細(xì)胞和CD16+ NK細(xì)胞更多，且Treg更少。在CD20+ B細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一群高表達(dá)CD86的FCRL4+FCRL5+ 非經(jīng)典記憶B細(xì)胞亞群【2】富集在MPR患者中。進(jìn)一步通過多色熒光染色發(fā)現(xiàn)這群B細(xì)胞位于三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）的中心部位。在獨(dú)立的驗證隊列中，MPR患者基線期的這群FCRL4+FCRL5+ B細(xì)胞的富集程度更高。此外，作者在另外兩個黑色素瘤隊列中也發(fā)現(xiàn)這群B細(xì)胞在反應(yīng)者的富集程度高于無反應(yīng)者。細(xì)胞互作分析發(fā)現(xiàn)這群B細(xì)胞可以通過CD86-CD28和CD40-CDLG激活濾泡輔助T細(xì)胞（follicular helper T，Tfh）產(chǎn)生IL21，而IL21可進(jìn)一步激活CD8+ T細(xì)胞【3】。
通過分析髓系細(xì)胞的異質(zhì)性，作者發(fā)現(xiàn)CD16+CX3CR1+ 的“巡邏”單核細(xì)胞[4]在MPR患者中富集，可能通過分泌CFP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。其信號的富集同樣可預(yù)測好的免疫治療效果（圖4）。由于采用BD單細(xì)胞測序平臺，作者獲得了較多的中性粒細(xì)胞。聚類后分為成熟和衰老的各兩個亞群，其中一群CCL3+ 的衰老中性粒細(xì)胞在MPR中明顯減少且在NMPR組中增加，而這群衰老的中性粒高表達(dá)PD-L1和IDO1等免疫檢查點(diǎn)且趨化因子IL8。通過細(xì)胞互作分析，作者發(fā)現(xiàn)CCL3+ 的衰老中心�？赡芎蚐PP1+ 巨噬細(xì)胞存在著正反饋調(diào)節(jié)以互相促進(jìn)增加：SPP1+巨噬細(xì)胞分泌SPP1誘導(dǎo)中性粒向衰老CCL3+ 表型轉(zhuǎn)化，而這群中性粒則分泌CCL3、CCL4等趨化因子反過來招募更多的SPP1+ 巨噬細(xì)胞。
綜上，本文利用臨床免疫治療前后的腫瘤以及外周血樣本，通過單細(xì)胞測序系統(tǒng)刻畫了免疫治療過程TME的變化，為后續(xù)肺癌免疫治療研究提供了珍貴的數(shù)據(jù)支持。作者對比MPR和NMPR的TME差異，提出FCRL4+FCRL5+ B細(xì)胞、CD16+CX3CR1+單核細(xì)胞和血漿雌激素變化特征是新的生物標(biāo)志物，并在獨(dú)立和公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證。結(jié)合BD平臺捕獲單細(xì)胞的優(yōu)勢，系統(tǒng)分析了免疫過程中中性粒細(xì)胞和治療應(yīng)答之間的關(guān)系。
同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬教授和同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王晨飛研究員為該論文共同通訊作者，同濟(jì)大學(xué)博士生胡俊杰、嚴(yán)以律、同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院助理研究員張樂樂和南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究生夏浩然為共同第一作者。
原文鏈接：
https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01164-9
參考文獻(xiàn)
1. Forde PM, Spicer J, Lu S, Provencio M, Mitsudomi T, Awad MM, et al. Neoadjuvant Nivolumab plus Chemotherapy in Resectable Lung Cancer. N Engl J Med. 2022; 386:1973-1985.
2. Li H, Dement-Brown J, Liao PJ, Mazo I, Mills F, Kraus Z, et al. Fc receptor-like 4 and 5 define human atypical memory B cells. Int Immunol. 2020; 32:755-770.
3. Cui C, Wang J, Fagerberg E, Chen PM, Connolly KA, Damo M, et al. Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaboration promotes anti-tumor CD8 T cell responses. Cell. 2021; 184:6101-6118.e6113.
4. Hanna RN, Cekic C, Sag D, Tacke R, Thomas GD, Nowyhed H, et al. Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science. 2015; 350:985-990.
近日，同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬課題組與同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王晨飛課題組與合作，于Genome Medicine 雜志在線發(fā)表題為Tumor Microenvironment Remodeling after Neoadjuvant Immunotherapy in Non-small Cell Lung Cancer Revealed by Single-Cell RNA Sequencing的研究論文。該研究利用單細(xì)胞及大量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single-cell and bulk RNA-seq）、非靶向代謝組學(xué)以及多色熒光染色系統(tǒng)刻畫NSCLC的TME在新輔助免疫治療中的動態(tài)變化，鑒定出新的生物標(biāo)志物以及潛在的耐藥的新機(jī)制。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序由伯豪生物提供服務(wù)
在該研究中，作者收集了15例IIIA期NSCLC新輔助免疫治療前后的原發(fā)腫瘤樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序，這些樣本被分為治療前（treatment-naïve，TN），治療后病理緩解組（MPR）以及非病理緩解組（NMPR）三組。此外作者還對另外21例新輔助免疫治療基線期的原發(fā)腫瘤樣本進(jìn)行bulk 轉(zhuǎn)錄組測序，作為獨(dú)立的驗證隊列（圖一）。質(zhì)控后總共獲得92330個單細(xì)胞，聚類后分為上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系細(xì)胞等。作者首先探索了腫瘤細(xì)胞在治療前后轉(zhuǎn)錄特征。通過三個組間的對比，發(fā)現(xiàn)MPR組的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出免疫激活的特征（高表達(dá)免疫細(xì)胞趨化因子CX3CL1和MHC-II相關(guān)分子），而NMPR組則高表達(dá)雌激素代謝相關(guān)的基因（AKR1C1-3）以及富集雌激素相關(guān)的通路。進(jìn)一步作者通過非靶向代謝組證實NMPR患者在治療過程中會出現(xiàn)血漿雌激素水平升高。圖1 研究樣本組成
接著研究人員進(jìn)一步分析各個免疫細(xì)胞亞群的動態(tài)變化。對比TN組，MPR和NMPR組的CD8+ T細(xì)胞和NK細(xì)胞均被激活，但是MPR組的殺傷性CD8+ T細(xì)胞和CD16+ NK細(xì)胞更多，且Treg更少。在CD20+ B細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)了一群高表達(dá)CD86的FCRL4+FCRL5+ 非經(jīng)典記憶B細(xì)胞亞群【2】富集在MPR患者中。進(jìn)一步通過多色熒光染色發(fā)現(xiàn)這群B細(xì)胞位于三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）的中心部位。在獨(dú)立的驗證隊列中，MPR患者基線期的這群FCRL4+FCRL5+ B細(xì)胞的富集程度更高。此外，作者在另外兩個黑色素瘤隊列中也發(fā)現(xiàn)這群B細(xì)胞在反應(yīng)者的富集程度高于無反應(yīng)者。細(xì)胞互作分析發(fā)現(xiàn)這群B細(xì)胞可以通過CD86-CD28和CD40-CDLG激活濾泡輔助T細(xì)胞（follicular helper T，Tfh）產(chǎn)生IL21，而IL21可進(jìn)一步激活CD8+ T細(xì)胞【3】。
通過分析髓系細(xì)胞的異質(zhì)性，作者發(fā)現(xiàn)CD16+CX3CR1+ 的“巡邏”單核細(xì)胞[4]在MPR患者中富集，可能通過分泌CFP誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。其信號的富集同樣可預(yù)測好的免疫治療效果（圖4）。由于采用BD單細(xì)胞測序平臺，作者獲得了較多的中性粒細(xì)胞。聚類后分為成熟和衰老的各兩個亞群，其中一群CCL3+ 的衰老中性粒細(xì)胞在MPR中明顯減少且在NMPR組中增加，而這群衰老的中性粒高表達(dá)PD-L1和IDO1等免疫檢查點(diǎn)且趨化因子IL8。通過細(xì)胞互作分析，作者發(fā)現(xiàn)CCL3+ 的衰老中心�？赡芎蚐PP1+ 巨噬細(xì)胞存在著正反饋調(diào)節(jié)以互相促進(jìn)增加：SPP1+巨噬細(xì)胞分泌SPP1誘導(dǎo)中性粒向衰老CCL3+ 表型轉(zhuǎn)化，而這群中性粒則分泌CCL3、CCL4等趨化因子反過來招募更多的SPP1+ 巨噬細(xì)胞。
綜上，本文利用臨床免疫治療前后的腫瘤以及外周血樣本，通過單細(xì)胞測序系統(tǒng)刻畫了免疫治療過程TME的變化，為后續(xù)肺癌免疫治療研究提供了珍貴的數(shù)據(jù)支持。作者對比MPR和NMPR的TME差異，提出FCRL4+FCRL5+ B細(xì)胞、CD16+CX3CR1+單核細(xì)胞和血漿雌激素變化特征是新的生物標(biāo)志物，并在獨(dú)立和公共轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中驗證。結(jié)合BD平臺捕獲單細(xì)胞的優(yōu)勢，系統(tǒng)分析了免疫過程中中性粒細(xì)胞和治療應(yīng)答之間的關(guān)系。
同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院張鵬教授和同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院王晨飛研究員為該論文共同通訊作者，同濟(jì)大學(xué)博士生胡俊杰、嚴(yán)以律、同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院助理研究員張樂樂和南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士研究生夏浩然為共同第一作者。
原文鏈接：
https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-023-01164-9
參考文獻(xiàn)
1. Forde PM, Spicer J, Lu S, Provencio M, Mitsudomi T, Awad MM, et al. Neoadjuvant Nivolumab plus Chemotherapy in Resectable Lung Cancer. N Engl J Med. 2022; 386:1973-1985.
2. Li H, Dement-Brown J, Liao PJ, Mazo I, Mills F, Kraus Z, et al. Fc receptor-like 4 and 5 define human atypical memory B cells. Int Immunol. 2020; 32:755-770.
3. Cui C, Wang J, Fagerberg E, Chen PM, Connolly KA, Damo M, et al. Neoantigen-driven B cell and CD4 T follicular helper cell collaboration promotes anti-tumor CD8 T cell responses. Cell. 2021; 184:6101-6118.e6113.
4. Hanna RN, Cekic C, Sag D, Tacke R, Thomas GD, Nowyhed H, et al. Patrolling monocytes control tumor metastasis to the lung. Science. 2015; 350:985-990.
標(biāo)簽：
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序
非小細(xì)胞肺癌
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