單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組測序揭示人類輸尿管中的細(xì)胞類型和信號網(wǎng)絡(luò)

01

單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組測序：揭示人類輸尿管中的細(xì)胞類型和信號網(wǎng)絡(luò)

本研究使用單細(xì)胞RNA測序、空間轉(zhuǎn)錄組測序和免疫熒光繪制人類輸尿管內(nèi)的細(xì)胞群空間圖譜，重點(diǎn)關(guān)注基質(zhì)細(xì)胞群和尿路上皮細(xì)胞群，以探索組成人類輸尿管的不同細(xì)胞類型，并推斷出支持這些腔室間雙向串?dāng)_的潛在細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)。研究者發(fā)現(xiàn)表達(dá)sonic hedgehog（SHH）的基底細(xì)胞支持體外類器官生成，并準(zhǔn)確預(yù)測從基底祖細(xì)胞向終末分化的傘狀細(xì)胞的分化軌跡，從而驗(yàn)證了SHH信號通路在成體祖細(xì)胞維持中的重要性。

總之，本研究結(jié)果揭示了參與成人輸尿管組織穩(wěn)態(tài)的基本過程，并為指導(dǎo)輸尿管組織工程提供了藍(lán)圖。

02

瘤內(nèi)微生物對腫瘤空間和細(xì)胞異質(zhì)性的影響

腫瘤相關(guān)微生物是人類腫瘤微環(huán)境的內(nèi)在組成部分，微生物可能對腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、免疫檢測、化學(xué)耐藥性存在影響，近年來研究表明至少33種主要的癌癥類型存在腫瘤內(nèi)微生物群，然而由于早期對組織采用的bulk組學(xué)的研究掩蓋了腫瘤內(nèi)微生物群的空間分布和局部效應(yīng)。

這篇文章通過對口腔鱗癌（OSCC）和結(jié)直腸癌（CRC）進(jìn)行原位空間分析技術(shù)和scRNA-seq檢測，來映射TME內(nèi)的宿主-細(xì)菌空間、細(xì)胞和分子相互作用。文章首先對11例CRC患者腫瘤的44個組織進(jìn)行了16s測序揭示了患者腫瘤內(nèi)微生物組的異質(zhì)性，然后通過RNAscope-熒光原位雜交成像確認(rèn)了這些細(xì)菌的空間異質(zhì)性，并觀察到細(xì)菌密集區(qū)域和細(xì)菌陰性區(qū)域。為了進(jìn)一步確認(rèn)瘤內(nèi)微生物的空間分布研究者利用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄分別對CRC和OSCC樣本進(jìn)行檢測，分別再28%和46%的spot中鑒定到了細(xì)菌轉(zhuǎn)錄本，并確定了各自的主要細(xì)菌種屬，為了進(jìn)一步鑒定微生物分布是否與TME有關(guān)，采用了GeoMx DSP空間蛋白檢測平臺靶向檢測了與抗腫瘤免疫和癌癥進(jìn)展相關(guān)的77種蛋白質(zhì)的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)CD45+免疫區(qū)室中細(xì)菌主要存在于高度免疫抑制的微環(huán)境中，宿主則可能是通過激活MAPK信號通路來抵抗瘤內(nèi)細(xì)菌，而與細(xì)菌陰性區(qū)域相比，腫瘤上皮區(qū)域（PanCK+）表現(xiàn)出血管化程度低，增值性低，p53表達(dá)低等特點(diǎn)。為了進(jìn)一步探究腫瘤微生物-宿主細(xì)胞間的互作以及互作關(guān)系對宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，研究者基于10x genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)了可以捕獲細(xì)菌rRNA的INVADEseq技術(shù)，結(jié)合激光共聚焦成像，對7例OSCC組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)患者的瘤內(nèi)微生物主要是梭桿菌屬和密螺旋體屬，主要存在于腫瘤上皮細(xì)胞以及源自單核細(xì)胞的巨噬細(xì)胞中，細(xì)菌存在誘導(dǎo)了上皮細(xì)胞IFN和JAK-STAT信號通路顯著上調(diào)，但與癌癥進(jìn)展相關(guān)基因的只有適度的影響，而在巨噬細(xì)胞中主要調(diào)控了免疫反應(yīng)和白介素生成的基因以及一系列的趨化因子表達(dá)的上調(diào)。后續(xù)濕實(shí)驗(yàn)中表明瘤內(nèi)微生物在招募與富集中性粒細(xì)胞方面起著積極作用，而具核梭桿菌感染可以促進(jìn)膠原基質(zhì)中癌細(xì)胞的侵襲，而且還可以改變癌細(xì)胞的運(yùn)動模式，并在功能層面上導(dǎo)致癌細(xì)胞的異質(zhì)性。

總的來說，該研究揭示了宿主細(xì)胞-微生物在空間、細(xì)胞和分子層面的相互作用，表明腫瘤患者瘤內(nèi)微生物的分布并非是隨機(jī)的，并且其分布特征與TME具有緊密的聯(lián)系。

03

亞細(xì)胞分辨率的RNA和蛋白成像技術(shù)-CosMx™ Spatial Molecular Imager

空間多組學(xué)層出不窮，然而以亞細(xì)胞分辨率來解析組織中分子的空間分布一直是一個挑戰(zhàn)，為了提高檢測的分辨率，在亞細(xì)胞水平中有限的分子背景下，必然要犧牲檢測的深度，因此原位探針捕獲效率，靶向分子的多少，panel設(shè)計(jì)的適用性決定了亞細(xì)胞分辨率新技術(shù)后續(xù)的市場占有率。

2022年9月NanoString公司Joe Beechem領(lǐng)導(dǎo)的研發(fā)團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology發(fā)表了最新的單細(xì)胞/亞細(xì)胞空間多組學(xué)創(chuàng)新平臺 — CosMx™ Spatial Molecular Imager（SMI）空間原位分子成像系統(tǒng)的研究文章，該技術(shù)基于原位雜交循環(huán)成像技術(shù)和熒光探針報(bào)告系統(tǒng)對FFPE樣本實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞分辨率的980個RNA和108個蛋白質(zhì)的空間原位表達(dá)信息進(jìn)行檢測。該技術(shù)對每個靶標(biāo)的基因設(shè)計(jì)了5個ISH探針，每個探針都具有獨(dú)特的捕獲序列，在ISH探針的末端是長度為60-80nt的DNA讀出區(qū)域，可以結(jié)合4個熒光報(bào)告器，實(shí)現(xiàn)分子信號的放大，這樣的設(shè)計(jì)保證了在不同組織背景中比較高的信噪比，比較準(zhǔn)確的空間單個RNA或蛋白分子的定量。在每次雜交成像后，通過UV照射和洗滌步驟有效地猝滅熒光信號，通過循環(huán)雜交城鄉(xiāng)實(shí)現(xiàn)多靶標(biāo)的檢測。該技術(shù)的特點(diǎn)包括：1.能夠?qū)崿F(xiàn)靶標(biāo)RNA的單細(xì)胞分辨率檢測，2.可以完成980個RNA和108個蛋白質(zhì)的多靶標(biāo)檢測，3.該技術(shù)可以在同一張玻片上完成RNA和蛋白同時定位，4.panel設(shè)計(jì)中包括了cell typing，cell-cell interaction，cellstate&function等不同模塊的分子，可以兼顧大多數(shù)研究需要的分子，5.設(shè)計(jì)中增加了細(xì)胞核染色混合抗體的通用染色，結(jié)合AI機(jī)器學(xué)習(xí)算法，合評判和精準(zhǔn)勾勒細(xì)胞邊界來完成細(xì)胞分割，精準(zhǔn)的細(xì)胞分割是下游數(shù)據(jù)分析（包括細(xì)胞分型、細(xì)胞狀態(tài)分析和細(xì)胞-細(xì)胞互作）的基礎(chǔ)，6.該技術(shù)支持研究者針對多種樣本類型FFPE和Fresh frozen，7.該平臺實(shí)驗(yàn)過程高度自動化，節(jié)省時間和勞動力。在文章中Nanostring團(tuán)隊(duì)利用該技術(shù)展示了非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌FFPE樣本中的細(xì)胞精細(xì)分型、不同細(xì)胞在組織中的空間位置定位，還可以直接檢測細(xì)胞交界處配受體的表達(dá)，進(jìn)而為深入揭示細(xì)胞異質(zhì)性、組織微環(huán)境、細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞功能和細(xì)胞間通訊機(jī)制帶來全新見解。

04

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示了IgG4-RD受累組織中T和B淋巴細(xì)胞相互作用的景觀以及Th1和Th2型反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)

由于Th反應(yīng)在IgG4相關(guān)疾病（IgG4-RD）中具有重要作用，因此，研究者意于闡明Th反應(yīng)的精確模式及其對潛在靶細(xì)胞群的影響，以深入了解IgG4-RD的致病機(jī)制。

研究者深入探討了IgG4-RD受累組織中T-B細(xì)胞相互作用、免疫受體譜及不同類型免疫應(yīng)答的影響。他們采用了單細(xì)胞RNA測序、BulkR NA測序、免疫受體庫分析(BCR和TCR)、多色流式細(xì)胞術(shù)、體外模型細(xì)胞和組織學(xué)方法，從多個方面研究IgG4-RD的免疫病理特征。結(jié)果顯示：晚期IgG4-RD患者可見異位生發(fā)中心形成，受累組織中大部分B細(xì)胞呈生發(fā)中心B細(xì)胞樣。IgG4-RD的生發(fā)中心反應(yīng)導(dǎo)致相關(guān)組織中TCR和BCR克隆的不規(guī)則性，不同樣本間克隆重疊有限。在IgG4-RD受累組織中觀察到Th1-和Th2型反應(yīng)增強(qiáng)，Th1-和Th2型反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞亞群均增加的患者具有更嚴(yán)重的炎癥指標(biāo)。對IgG4- RD中IgG4轉(zhuǎn)錄本來源的分析表明，IgG4可以直接從IgM轉(zhuǎn)移，也可以從其他IgG亞類轉(zhuǎn)移。EVB永生化的B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)顯示Th1型和Th2型反應(yīng)對生發(fā)中心反應(yīng)、MHC-II分子異位表達(dá)和三級淋巴樣結(jié)構(gòu)形成的影響。因此，Th1-和Th2型反應(yīng)的協(xié)同作用通過影響急性炎癥過程和IgG4-RD的慢性和復(fù)雜性參與了IgG4-RD的發(fā)病機(jī)制。

05

人星形膠質(zhì)細(xì)胞再生腦類器官修復(fù)脊髓損傷

脊髓損傷(SCI)是中樞神經(jīng)損傷的一類，導(dǎo)致不可逆的中樞神經(jīng)組織喪失，目前研究表明移植不同類型的神經(jīng)細(xì)胞可在不同程度上改善SCI小鼠的運(yùn)動功能，這表明神經(jīng)細(xì)胞移植治療脊髓損傷具有重大的應(yīng)用潛力。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的2D神經(jīng)細(xì)胞移植可以避免免疫排斥，但存在成瘤風(fēng)險(xiǎn)、定向分化操作復(fù)雜以及移植后的隨機(jī)擴(kuò)散等問題。脊髓是高度特化的神經(jīng)組織，無論體外或體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生具有精細(xì)結(jié)構(gòu)的脊髓組織都面臨巨大挑戰(zhàn)。利用中樞神經(jīng)細(xì)胞直接再生出具有精細(xì)結(jié)構(gòu)的3D腦與脊髓類器官，將為中樞神經(jīng)組織損傷修復(fù)提供更大的應(yīng)用潛力。

本文研究者系統(tǒng)性開展了不同發(fā)育階段星形膠質(zhì)細(xì)胞重編程神經(jīng)類器官的研究，用小分子化合物誘導(dǎo)星形角質(zhì)細(xì)胞編程為神經(jīng)外胚層細(xì)胞，再經(jīng)過懸浮培養(yǎng)，自組裝形成皮層類器官，該皮層類器官具有典型的腦室區(qū)結(jié)構(gòu)，并可成熟分化為腦室下區(qū)神經(jīng)元。為了形成脊髓類器官，通過精準(zhǔn)調(diào)控脊髓特異的誘導(dǎo)信號（如SHH, BMP4, bFGF 和RA），重編程后的神經(jīng)外胚層細(xì)胞可定向誘導(dǎo)為具有背側(cè)結(jié)構(gòu)的脊髓類器官，然后通過免疫染色和單細(xì)胞測序分析評估類器管的細(xì)胞成分，發(fā)現(xiàn)：脊髓類器官包含運(yùn)動神經(jīng)元，GABA能中間神經(jīng)元和谷氨酸能興奮性神經(jīng)元等豐富的神經(jīng)細(xì)胞類群；電生理和微電極陣列分析表明脊髓類器官具有成熟的電生理活性。最后，團(tuán)隊(duì)繼續(xù)將該脊髓類器官移植到脊髓段組織完全切除的免疫缺陷小鼠模型病灶區(qū)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脊髓類器官不僅能夠在病灶區(qū)存活，維持脊髓類器官細(xì)胞特征，而且能夠遷移到小鼠正常脊髓組織內(nèi)部，與宿主神經(jīng)元建立突觸連接。這在一定程度上起到連接上下行脊髓神經(jīng)的作用，很好改善下行脊髓萎縮的癥狀。

總之，該研究開創(chuàng)了人星形膠質(zhì)細(xì)胞直接重編程為神經(jīng)類器官的方法，首次實(shí)現(xiàn)了直接利用體細(xì)胞再生3D神經(jīng)組織修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，為今后中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織損傷修復(fù)提供了可能。

參考文獻(xiàn)：

[1] Fink EE, Sona S, Tran U, Desprez PE, Bradley M, Qiu H, Eltemamy M, Wee A, Wolkov M, Nicolas M, Min B, Haber GP, Wessely O, Lee BH, Ting AH. Single-cell and spatial mapping Identify cell types and signaling Networks in the human ureter. Dev Cell. 2022 Aug 8;57(15):1899-1916.e6. doi: 10.1016/j.devcel.2022.07.004. Epub 2022 Jul 31. PMID: 35914526; PMCID: PMC9381170.

[2] Galeano Niño JL, Wu H, LaCourse KD, Kempchinsky AG, Baryiames A, Barber B, Futran N, Houlton J, Sather C, Sicinska E, Taylor A, Minot SS, Johnston CD, Bullman S. Effect of the intratumoral microbiota on spatial and cellular heterogeneity in cancer. Nature. 2022 Nov 16. doi: 10.1038/s41586-022-05435-0. Epub ahead of print. PMID: 36385528.

[3] He S, Bhatt R, Brown C, Brown EA, Buhr DL, Chantranuvatana K, Danaher P, Dunaway D, Garrison RG, Geiss G, Gregory MT, Hoang ML, Khafizov R, Killingbeck EE, Kim D, Kim TK, Kim Y, Klock A, Korukonda M, Kutchma A, Lewis ZR, Liang Y, Nelson JS, Ong GT, Perillo EP, Phan JC, Phan-Everson T, Piazza E, Rane T, Reitz Z, Rhodes M, Rosenbloom A, Ross D, Sato H, Wardhani AW, Williams-Wietzikoski CA, Wu L, Beechem JM. High-plex imaging of RNA and proteins at subcellular resolution in fixed tissue by spatial molecular imaging. Nat Biotechnol. 2022 Oct 6. doi: 10.1038/s41587-022-01483-z. Epub ahead of print. PMID: 36203011.

[4] Cai S, Chen Y, Hu Z, Zhou T, Huang Y, Lin S, Gao R, Zhong J, Dong L. The landscape of T and B lymphocytes interaction and synergistic effects of Th1 and Th2 type response in the involved tissue of IgG4-RD revealed by single cell transcriptome analysis. J Autoimmun. 2022 Nov 16;133:102944. doi: 10.1016/j.jaut.2022.102944. Epub ahead of print. PMID: 36401985.

[5] Xu J, Fang S, Deng S, Li H, Lin X, Huang Y, Chung S, Shu Y, Shao Z. Generation of neural organoids for spinal-cord regeneration via the direct reprogramming of human astrocytes. Nat Biomed Eng. 2022 Nov 24. doi: 10.1038/s41551-022-00963-6. Epub ahead of print. PMID: 36424465.

免責(zé)聲明：本文資源來源于網(wǎng)絡(luò)，版權(quán)歸原作者所有，本文資源僅供學(xué)習(xí)使用，不作任何商業(yè)用途，若有侵權(quán)，請聯(lián)系后臺刪除。