熒光顯微鏡成像中背景熒光的成因及解決方案

熒光顯微鏡的熒光染色背景太強如何解決
 

熒光顯微鏡相比普通光學(xué)顯微鏡有高特異性、高靈敏度等優(yōu)勢，是現(xiàn)代實驗室必不可少的工具，而使用熒光顯微鏡成像拍照，怕的就是出現(xiàn)高強度的熒光染色背景，因為這會降低成像信噪比，導(dǎo)致樣品信號不清晰、細(xì)節(jié)丟失。那么熒光染色背景太強有哪些成因呢？又如何避免呢？
 

一、環(huán)境光導(dǎo)致的背景熒光
 

環(huán)境光導(dǎo)致熒光顯微鏡背景熒光增強是很常見的情況，因為環(huán)境光沒有經(jīng)過激發(fā)濾光片的過濾，所以有可能包含激發(fā)光在內(nèi)的各種波長光，這可能會帶來額外的背景熒光和雜散光。
  很多老師會用暗室成像，或用衣服/遮光罩把熒光顯微鏡遮光來成像，這對降低一些背景熒光和雜散光是有意義的，有條件可以參考。
 

二、透射聚光鏡導(dǎo)致的背景熒光
 

目前使用的熒光顯微鏡主要是落射熒光顯微鏡，也就是說，熒光激發(fā)光從物鏡出來，照射樣品，然后發(fā)射光回到物鏡成像。由于樣品玻片是透明的，因此激發(fā)光穿過樣品后還會進(jìn)入透射光路的聚光鏡，再反射并聚光回樣品上，形成強背景熒光。
  我們以升級熒光觀察的正置顯微鏡明美MF31和倒置顯微鏡明美MF52-N為例，給大家介紹如何解決這個問題。
  首先是正置熒光顯微鏡MF31，在進(jìn)行調(diào)整前，有非常強的同色背景熒光，導(dǎo)致樣品信號比較難分辨。 首先下調(diào)聚光鏡高度，部分機(jī)子可能有限位裝置，需要先解除限位再下降。把聚光鏡光闌收到小，或把黑卡紙、牛皮紙之類不反光的紙片，插到聚光鏡頂部和載物臺之間。
  可以看到背景熒光得到了大幅改善，這個信噪比足夠后期把背景熒光處理掉了。 倒置熒光顯微鏡MF52-N方面，在進(jìn)行調(diào)整前，有偏紅的背景熒光和雜散光出現(xiàn)，影響成像純凈度。 由于倒置顯微鏡無法調(diào)節(jié)工作高度，也不方便放置遮光板，因此可以做簡單的操作，把聚光鏡的孔徑光闌收到小，光闌的葉片會阻擋發(fā)射光透過，就避免了額外的背景熒光。
  孔徑光闌收小之后，偏紅的背景熒光就消失了，樣品信噪比得到了改善。

三、來自樣品、器皿和介質(zhì)的背景熒光
 

上述兩種背景熒光，都不會因為樣品移動而變化，如果樣品移動背景熒光也有變動，那么問題可能就出在樣品、器皿或者介質(zhì)，需要針對性處理。
  比如樣品有未結(jié)合的染料，需測試優(yōu)化合適的熒光染料濃度，并在樣品處理時使用PBS多漂洗幾次，去除未結(jié)合的染料。
  如果樣品有自發(fā)熒光造成干擾，可能需要嘗試其他通道的染料進(jìn)行標(biāo)記，另外塑料器皿也可能有背景熒光，建議使用無熒光的玻璃器皿。 如果使用多孔板，可以設(shè)置一些不帶樣品的對照孔來獲取背景熒光強度信息，方便后期處理時可以把背景熒光扣除掉。

免疫熒光標(biāo)記的固定細(xì)胞成像，如果出現(xiàn)背景熒光問題，需要檢查封片劑，高倍觀察的話還要注意鏡油是否為無熒光鏡油。

好了，以上就是本期對熒光顯微鏡成像背景熒光強的成因和一些解決方法的介紹，希望對大家的日常實驗和實驗室管理有幫助。

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