活體顱骨光透明技術(shù)在光學(xué)成像中的應(yīng)用

       活體腦成像對(duì)于研究大腦生理病理活動(dòng)有著至關(guān)重要的意義�，F(xiàn)代光學(xué)成像技術(shù)侵入性低、分辨率高，因而能夠用于活體觀測生物結(jié)構(gòu)和功能，在腦科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。但是，在活體狀態(tài)下，大腦表面的顱骨對(duì)光的強(qiáng)散射嚴(yán)重限制了光的穿透深度，進(jìn)而影響了皮層成像的深度和質(zhì)量。為了克服顱骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各類手術(shù)顱窗，主要包括開顱玻璃窗、磨薄顱骨窗以及它們的變體。開顱玻璃窗雖然可用于動(dòng)物腦部成像，但是，開顱手術(shù)容易導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而開顱后3天逐漸形成白色絮狀物影響后續(xù)成像效果，且往往會(huì)持續(xù)約 2周，因此并不適合急性模型（3天以內(nèi)）的觀測及長期（2周以上）活體成像監(jiān)測。磨薄顱骨窗的建立通過將部分顱骨磨薄至約 25 μm左右，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)皮層的活體高分辨觀測。但磨薄顱骨窗不適用于大視場觀測皮層，因?yàn)閷⒋竺娣e的顱骨均勻地磨薄至25 μm的難度非常大。另外，顱骨被磨薄后會(huì)重新生長，并且新生的顱骨易碎，難以實(shí)現(xiàn)多次的重復(fù)打磨。所以，磨薄顱骨窗不適用于長期反復(fù)跟蹤觀測。

       近些年興起的組織光透明技術(shù)可以降低生物組織的散射，增強(qiáng)光在組織中的穿透能力，已被廣泛應(yīng)用于離體大組織甚至全器官三維高分辨成像。不僅如此，組織光透明技術(shù)在活體水平也得到了很好的應(yīng)用。研究人員發(fā)展的活體顱骨光透明技術(shù)，以及基于此建立的光透明顱窗，可以在不進(jìn)行開顱手術(shù)的情況下，結(jié)合多種現(xiàn)代光學(xué)成像手段，實(shí)現(xiàn)大腦皮層的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)和功能的無創(chuàng)成像觀測。針對(duì)不同的應(yīng)用場景，開發(fā)了不同的光透明顱窗，可以分別滿足高分辨、大視場、長時(shí)程觀測等要求。相比于開顱玻璃窗，光透明顱窗可以避免手術(shù)帶來的炎癥反應(yīng)等副作用，從而適用于急性觀測；而相比于磨薄顱骨窗，光透明顱窗可以通過反復(fù)建立而觀測數(shù)月，從而實(shí)現(xiàn)長期跟蹤監(jiān)測。

       目前的活體顱骨光透明方法包括以下幾種：（1）用于提升皮層血管成像質(zhì)量的顱骨光透明方法（SOCS）[1]；（2）用于實(shí)現(xiàn)神經(jīng)樹突棘分辨的顱骨光透明方法（SOCW）[2]；（3）大視場、可重復(fù)性顱骨光透明方法（USOCA）[3]；（4）可見-近紅外兼容的光透明方法（VNSOCA）[4]；（5）用于長期觀測的顱骨光透明方法（TIS）[5]。本文主要介紹活體顱骨光透明技術(shù)在光學(xué)成像中的應(yīng)用。

（1）激光散斑襯比/高光譜成像

       血流和血氧變化是反應(yīng)血管功能的重要指標(biāo)，監(jiān)測皮層血流、血氧信息對(duì)于研究多種腦疾病有著重要的意義。激光散斑襯比成像是一種非標(biāo)記的、高時(shí)空分辨的血流分布成像技術(shù)；高光譜成像技術(shù)是一種非標(biāo)記的血氧分布成像技術(shù)。顱骨光透明技術(shù)的出現(xiàn)使其得以在完整顱骨下獲取皮層血流及血氧信息。

圖1. 重復(fù)光透明成像用于皮層血流和血氧監(jiān)測[3]。（a）顱骨短期重復(fù)透明成像；

（b）顱骨長期重復(fù)透明成像。

       利用顱骨光透明技術(shù)，可以持續(xù)一周地每天對(duì)小鼠進(jìn)行顱骨透明化操作并獲取血流血氧信息（圖1. a）。不僅如此，研究人員對(duì) 2 月齡的小鼠進(jìn)行了每月一次、為期 5個(gè)月的持續(xù)成像，并成功觀察到皮層血管網(wǎng)的動(dòng)態(tài)變化，即部分血管的消失和新生（圖1. b）。除了對(duì)單側(cè)顱骨進(jìn)行透明外，研究人員還對(duì)小鼠雙側(cè)顱骨進(jìn)行光透明處理，用于監(jiān)測大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）后雙側(cè)皮層血流及血氧變化（圖2）。

圖2. 光透明顱窗用于監(jiān)測MCAO引起的皮層血流動(dòng)力學(xué)變化[3]。（a）MCAO前后雙側(cè)皮層血流及血氧變化；（b-c）皮層血流及血氧變化柱狀圖。

（2）光聲成像

      光聲成像是近十年來出現(xiàn)的一種基于激光超聲的生物醫(yī)學(xué)成像新方法。它是一種混合成像方式，結(jié)合了光學(xué)成像的高對(duì)比度和基于光譜的特異性以及超聲成像的高穿透深度，克服了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)成像手段的不足。然而，由于顱骨的存在，光聲成像在大腦中的應(yīng)用受到了阻礙。顱骨光透明技術(shù)可以通過降低光學(xué)散射特性來改善光進(jìn)入深層組織的傳輸。研究人員發(fā)現(xiàn)，顱骨光透明技術(shù)可以抑制渾濁顱骨所引入的激光和刺激超聲的衰減和失真，增加光聲成像的光學(xué)分辨率（OR）和聲學(xué)分辨率（AR），而且光聲顯微鏡用于大腦微血管成像的性能提高（圖3）。該技術(shù)為解決光聲成像中顱骨受限問題提供了一種簡便易行的方法，對(duì)神經(jīng)血管學(xué)研究具有重要意義。

圖3. 光透明顱窗結(jié)合光聲成像觀察皮層血管結(jié)構(gòu)[6]。(a) 未處理顱骨的反射圖像；(b) 顱骨光透明后顱骨的反射圖像；(c) 完整顱骨的光聲成像；(d) 顱骨光透明后的光聲成像；

(e) 圖(c)和(d)中綠色箭頭所示同一血管的光聲信號(hào)；(f) 顱骨光透明處理前后光聲信號(hào)

振幅和血管直徑的統(tǒng)計(jì)分析。

（3）受激拉曼成像

      受激拉曼散射成像是一種新型的相干拉曼散射成像技術(shù)，利用基于分子振動(dòng)特征的化學(xué)特異性，可以實(shí)現(xiàn)無標(biāo)記生物成像，展現(xiàn)出了無標(biāo)記、快速、高靈敏度、高特異性等優(yōu)勢。研究人員通過受激拉曼成像分析了顱骨光透明過程中顱骨的主要成分---膠原蛋白和羥基磷灰石（鈣質(zhì)）的變化，對(duì)顱骨光透明技術(shù)的作用機(jī)制進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)活體顱骨光透明的基本原理是（部分）去除顱骨中的鈣質(zhì)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并使用折射率匹配試劑進(jìn)一步提高透明效果（圖4）。該研究為未來活體光透明方法的發(fā)展提供了理論依據(jù)，可以用于篩選更高效的活體顱骨及其他組織光透明方法。

圖4. 受激拉曼成像揭示顱骨光透明技術(shù)的機(jī)制[7]。（a-c）幼年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石顯微結(jié)構(gòu)圖像。顱骨未處理（a），10 %膠原酶處理（b），10 % EDTA處理（c）。

（d-f）成年小鼠頂骨中膠原纖維和羥基磷灰石的微觀結(jié)構(gòu)變化。顱骨未處理（d）， USOCA處理（e），10 % EDTA處理（f）。

（4）雙光子/三光子成像

       與其它光學(xué)活體成像相比，雙光子/三光子成像具有較高的空間分辨率，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與亞細(xì)胞分辨水平的結(jié)構(gòu)成像研究，已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)有力的研究工具。一般來說，雙光子/三光子應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)研究時(shí)需要配合開顱玻璃窗或者磨薄顱骨窗，而活體顱骨光透明技術(shù)的發(fā)展為其應(yīng)用提供了一種新型的非侵入式的觀測思路。

圖5. 光透明顱窗結(jié)合雙光子成像監(jiān)測皮層樹突棘可塑性[2]。

       研究人員借助光透明顱窗，成功實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)元突觸可塑性的觀測。在建立光透明顱窗后，雙光子成像獲取的神經(jīng)信號(hào)的圖像質(zhì)量得到顯著改善，足以對(duì)樹突棘進(jìn)行清晰地成像。隨后對(duì)小鼠神經(jīng)元樹突棘進(jìn)行持續(xù)觀測，觀察樹突棘的出現(xiàn)和消失、以及形狀的變化（圖5）。除了高分辨率成像外，顱骨光透明技術(shù)通過在顱骨表面滴加化學(xué)試劑使顱骨透明，因此可以用于大視場的透明成像。如圖6所示，研究人員可以對(duì)小鼠顱骨頂部進(jìn)行大范圍透明處理，進(jìn)而通過雙光子成像對(duì)皮層血管和神經(jīng)進(jìn)行大視野和高分辨成像。

圖6. 光透明顱窗結(jié)合雙光子用于大視場、高分辨成像[5]。

       常規(guī)的活體顱骨光透明技術(shù)在光透明顱窗建立過程中需要先將小鼠麻醉，然后使用化學(xué)試劑進(jìn)行處理，而且成像過程中液體的化學(xué)試劑需要保持在顱骨表面。但是純粹的液體試劑無法應(yīng)用于清醒或自由活動(dòng)的小鼠皮層的觀測。而最新發(fā)展的長效光透明技術(shù)，光透明顱窗在建立后可以在小鼠顱骨上維持?jǐn)?shù)周，從而可以滿足對(duì)清醒動(dòng)物進(jìn)行成像的需求。借助于這種長效光透明技術(shù)，研究人員在光透明顱窗建立后2周內(nèi)對(duì)清醒小鼠的神經(jīng)活動(dòng)進(jìn)行了觀測。在2周的觀測期間內(nèi)，神經(jīng)元的雙光子成像效果保持良好，可以清晰地通過鈣信號(hào)變化觀察神經(jīng)元活性。

圖7. 光透明顱窗透明效果的長期保持（a）及用于清醒動(dòng)物鈣信號(hào)成像（b）[5]。

      與雙光子成像技術(shù)相比，三光子成像技術(shù)擁有更高的空間分辨率。此外，由于三光子熒光與三次諧波發(fā)光所用的激發(fā)波長相較于雙光子更長，因此具有更大的成像深度。這些特征使三光子成像在深層組織和高分辨生物成像領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。而活體顱骨光透明技術(shù)同樣可以用于三光子成像。經(jīng)過顱骨光透明作用后，三光子成像獲取的皮層血管三次諧波信號(hào)得到顯著增加，而且皮層神經(jīng)元成像的深度和對(duì)比度都得到顯著提升（圖8），這為腦皮層深層信號(hào)的獲取提供了有力的手段。

圖8. 光透明顱窗用于三光子成像[4, 5]。（a-c）顱骨光透明作用前后皮層血管白光圖（a）、三次諧波信號(hào)（b）、神經(jīng)元信號(hào)三維重構(gòu)（c）。

（5）光操控

      現(xiàn)代光學(xué)技術(shù)不僅可以獲得高分辨率的神經(jīng)血管圖像，而且可以對(duì)大腦皮層進(jìn)行操控或建立特定的模型。基于顱骨光透明技術(shù)的窗口，也可替代開顱窗和磨薄窗，用于皮層光操控。比如，結(jié)合光透明顱窗和光動(dòng)力效應(yīng)，既可以打開血腦屏障，也可以建立靶向缺血性腦卒中模型；此外，透過光透明顱窗，將飛秒激光聚焦在血管上，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單根血管的燒蝕，從而建立局部靶向的出血性腦卒中模型。

       研究人員利用光透明顱窗，在不開顱的情況下實(shí)現(xiàn)了光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障，并可以在活體水平跟蹤熒光染料的滲漏過程（圖9. a），隨后進(jìn)一步研究了光動(dòng)力效對(duì)于不同年齡小鼠血腦屏障功能影響的差異性。這些研究為腦藥物遞送和腦疾病的治療提供了一種新的手段。此外，研究人員還將活體顱骨光透明技術(shù)與光栓技術(shù)相結(jié)合，在非開顱的情況下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腦皮層血管的靶向栓塞。通過改變激光照射位置和照射劑量，可以對(duì)栓塞程度和栓塞區(qū)域進(jìn)行調(diào)節(jié)（圖9. b），該模型可以用于評(píng)估溶栓藥物對(duì)不同尺寸血管的溶栓治療效果。

圖9. 顱骨光透明技術(shù)用于皮層光操控[8, 9]。（a）光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦

屏障；（b）光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)實(shí)現(xiàn)光栓模型建立。

展望

      近年來發(fā)展的顱骨光透明技術(shù)為活體皮層觀測提供了一個(gè)無需開顱的光學(xué)窗口。隨著光透明顱窗的出現(xiàn)，光聲成像、激光散斑成像、雙光子/三光子成像、近紅外二區(qū)成像、高光譜成像和非線性顯微成像等多種光學(xué)成像技術(shù)被應(yīng)用于活體觀察皮層神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞及血管結(jié)構(gòu)和功能。借助光透明顱窗，可以動(dòng)態(tài)觀測神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)元自發(fā)或?qū)Υ碳さ捻憫?yīng)、長時(shí)程監(jiān)測血管的修剪與新生、表層與深層的血液流速變化等[10, 11]。此外，光透明顱窗技術(shù)還有望與光學(xué)相干層析成像技術(shù)相結(jié)合，有潛力在無需標(biāo)記的情況下獲取皮層深組織的血管結(jié)構(gòu)與功能信息。不僅如此，顱骨光透明技術(shù)也為皮層靶向光操控提供了非侵入性的窗口。利用飛秒激光，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)血管的靶向損傷；結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)血腦屏障的開放或建立光栓模型。這也極大的拓展了顱骨光透明技術(shù)的應(yīng)用場景，有望在多種病理模型的研究中發(fā)揮作用。

      隨著顱骨光透明技術(shù)的不斷發(fā)展，至今已有多種光透明顱窗可供選擇。而光透明顱窗發(fā)展至今，已同時(shí)具備了高分辨、大視場、長時(shí)程、適用于急性觀測的優(yōu)勢，因而有望在某些傳統(tǒng)顱窗無法勝任的場合（比如急性創(chuàng)傷性腦損傷的跨腦區(qū)觀測，以及顱骨下方腦膜的結(jié)構(gòu)與功能成像）提供重要的技術(shù)支撐，從而在未來的腦科學(xué)研究中大放異彩。

       誠然，目前顱骨光透明技術(shù)依然有所限制。比如，對(duì)于更大動(dòng)物的活體顱骨光透明方法并不完善。對(duì)于大鼠顱骨的活體透明需要先將顱骨磨薄，才能獲得較好的透明效果，目前佳維斯團(tuán)隊(duì)正在先前小鼠顱骨透明技術(shù)基礎(chǔ)上開發(fā)大鼠顱骨透明技術(shù)，相信不久以后這款新產(chǎn)品也即將推向市場并服務(wù)于廣大科研工作者。而對(duì)于大型靈長類動(dòng)物（如獼猴），尚未有適用的活體顱骨光透明方法。這需要研究人員繼續(xù)探索更高效的顱骨光透明方法。未來更有效的顱骨光透明技術(shù)的出現(xiàn)，結(jié)合更多的成像方法（如大視場、高分辨且同時(shí)擁有大景深的光場顯微成像技術(shù)），將會(huì)為腦科學(xué)的發(fā)展提供更有力的技術(shù)保障！

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