DAP-seq技術在葡萄VvMADS28參與胚珠發(fā)育的調控機制研究中的應用
葡萄是一種營養(yǎng)豐富、美味可口的水果，深受世界各地消費者的喜愛。近年來，無籽葡萄也越來越受大家的歡迎，因此，無籽葡萄品種的培育成為一個重要的育種目標，而了解葡萄種子發(fā)育的分子遺傳調控機制對于無籽栽培品種的培育至關重要。
2023年4月13日，西北農林科技大學王西平課題組的最新研究成果，發(fā)表在Horticulture Research期刊上(影響因子7.291)，文章題目為“Control of ovule development in Vitis vinifera by VvMADS28 and interacting genes”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了葡萄中一個MADS-box轉錄因子的結合基序及其靶基因，揭示了VvMADS28參與葡萄胚珠和種子發(fā)育的調控機制，為培育無籽葡萄新品種奠定了理論基礎。
MADS-box基因編碼高等植物中的一大類轉錄因子，并在植物發(fā)育過程中發(fā)揮各種作用，包括花、果實和種子發(fā)育。MADS結構域蛋白通常以同型二聚體或異型二聚體的形式相互作用，從而擴展了功能多樣性。在葡萄中，已經發(fā)現(xiàn)了幾個參與種子形成的MADS-box基因（VviAGL11、VvAG2、VvSEP3、VvMADS39、VvMADS45）。該課題組在之前發(fā)表的工作中揭示了VvMADS45在葡萄種子發(fā)育中的作用，以及VvMADS39在花和胚珠發(fā)育中作用。本研究主要對MADS-box家族的VvMADS28進行進一步的功能驗證及其分子調控機制的探究。
圖1. VvMADS28的表達模式分析及亞細胞定位
本研究首先對葡萄中VvMADS28的時空表達模式進行研究。RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，VvMADS28在有籽葡萄“紅地球”和無籽葡萄“湯普森無核”的多種組織中普遍都有表達。其中，表達最強烈的組織是花序、花、果實，表達最弱的是根和葉。在胚珠發(fā)育過程中，VvMADS28在“紅地球”30 DAF（開花后天數(shù)）表達最強烈，此后在“紅地球”中的表達一直強于“湯普森無核”，而且“紅地球”中VvMADS28基因的較強表達模式與種子發(fā)育相一致。此外，原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)，在2個品種的15 DAF胚珠中均能檢測到VvMADS28的mRNA表達。“紅地球”中在30 DAF和35 DAF時均有相對較強的表達。相比之下，“湯普森無籽”胚珠在25 DAF后幾乎沒有表達。該結果與RT-qPCR結果相似。以上這些結果表明，VvMADS28在珠被的形成中起重要作用。基因功能不僅由基因的時空表達模式決定，還與該基因產物的亞細胞定位有關。在擬南芥原生質體中表達攜帶GFP標簽的VvMADS28，檢測到熒光信號定位于細胞核，這表明VvMADS28是一個轉錄調控因子。
通過ChIP-qPCR發(fā)現(xiàn)，在“湯普森無核”胚珠中VvMADS28的抑制與H3K27me3有關。在轉基因番茄中VvMADS28的過表達，導致萼片增大、果實變小、種子數(shù)量減少，而種子大小沒有顯著的變化。與對照組相比，利用“紅地球”構建的VvMADS28-RNAi株系表現(xiàn)為種子質量減少、果實和種子體積縮小、種子萎縮且排列不規(guī)格、種皮細胞排列松散。這些結果說明VvMADS28在維持正常的種子發(fā)育中起重要作用。采用酵母單雜交（Y1H）技術鑒定到VvMADS28上游的一個調控基因VvERF98，該基因編碼一個乙烯反應因子，它在2個葡萄品種中的表達模式與VvMADS28相似。此外，雙熒光素酶報告實驗、VvERF98-GUS 過表達實驗進一步證明了VvERF98可以正調控VvMADS28的表達。隨后，將種子用10 mM乙烯利處理，發(fā)現(xiàn)VvERF98和VvMADS28的表達水平均顯著升高。這說明在種子發(fā)育過程中VvERF98是VvMADS28上游的一個轉錄調控因子，且可以響應乙烯信號。
圖2. DAP-seq分析葡萄VvMADS28的結合基序及其潛在靶基因
采用酵母雙雜交（Y2H）技術，篩選了葡萄胚珠發(fā)育相關的VvMADS28的互作蛋白，并鑒定到VvMADS5蛋白。利用Co-IP、split-LUC互補分析，進一步驗證了VvMADS28與VvMADS5之間的互作關系。
為進一步闡明VvERF98、VvMADS5和VvWUS在種子發(fā)育中的相互作用，于是利用擬南芥分別構建了每個基因相應的轉基因株系，以便開展功能分析。在OE-VvMADS5株系中，葉片和角果增大、種子大小和重量增加，說明VvMADS5在胚珠和器官發(fā)育中起重要作用。同樣，在OE-VvERF98株系中，種子也增大，說明VvERF98 參與了胚珠的發(fā)育。相反，在OE-VvWUS株系中，葉片扭曲并產生簇狀分支、角果和種子縮小。VvWUS的mRNA在“湯普森無核”胚珠中高度積累，而VvMADS5和VvERF98的表達模式卻與之相反。
圖3. VvMADS28調控種子發(fā)育的分子機制網絡模型
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/hr/uhad070.
