Nature子刊：阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）和阿爾茨海默病(AD)的聯(lián)系

    阻塞性睡眠呼吸暫停（OSA）是睡眠呼吸障礙（SDB）中最常見的一種形式，是導(dǎo)致阿爾茨海默病發(fā)展的一個強有力的流行病學(xué)危險因素。據(jù)估計，大約 50% 的老年人患有阻塞性睡眠呼吸暫停（Obstructive Sleep Apnoea，OSA），他們的喉嚨肌肉在睡眠時間歇性收縮，阻塞氣道，導(dǎo)致呼吸停止和開始。當(dāng)大腦缺氧時，會導(dǎo)致神經(jīng)元的選擇性退化，這些神經(jīng)元通常會在失智癥中死亡。

    昆士蘭大學(xué)（University of Queensland，UQ）昆士蘭腦研究所（Queensland Brain Institute，QBI）和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院（School of Biomedical Sciences）的 Elizabeth Coulson 教授和她的團隊在小鼠身上發(fā)現(xiàn)了睡眠時大腦缺氧和阿爾茨海默病之間的因果關(guān)系。研究結(jié)果近日發(fā)表在《Nature Communications》雜志上。

     該研究團隊開發(fā)了一種小鼠SDB模型，該方法復(fù)制了人類條件的關(guān)鍵特征：睡眠時的呼吸改變、睡眠中斷、中度低氧血癥和認知障礙。當(dāng)在家族性AD模型中誘導(dǎo)SDB時，小鼠表現(xiàn)出認知障礙的加重和AD的病理特征，包括淀粉樣蛋白和炎癥標志物水平的增加，以及膽堿能基底前腦神經(jīng)元的選擇性變性。這些病理特征并不是單獨由慢性缺氧或睡眠中斷而引起的。我們的研究結(jié)果還顯示，膽堿能神經(jīng)退行性變是由核缺氧誘導(dǎo)因子1 alpha的積累介導(dǎo)的。此外，在睡眠期間恢復(fù)血氧水平以防止缺氧，可以防止SDB引起的病理改變。這些發(fā)現(xiàn)提示了SDB誘導(dǎo)膽堿能基底前腦變性的信號機制。

研究實驗

    將C57BL/6麻醉后，為了誘導(dǎo)膽堿能（ cMPT）病變，在背側(cè)被蓋核(laterodorsal tegmental nucleus) (LDT; AP, −3.0 mm; ML, ±0.5 mm; DV, −4.0 mm from Bregma, with the angle 34° backward)雙側(cè)注射 Urotensin II-SAPorin (UII- SAP; 0.07 μg/μl per site)。以相同的摩爾質(zhì)量注射blank-SAPorin（Blank-SAP）或 IgG-SAPorin (IgG-SAP)作為對照。

     為了測量睡眠狀態(tài)，采用無線遙測技術(shù)測量腦電圖（EEG）、肌電圖（EMG）和活動節(jié)律。腦電電極被放置于運動皮層（AP+1, ML+1 mm，左，相對于bregma）和視覺皮層（AP−3, ML+3 mm，右，相對于bregma）。腦電電極用骨科水泥固定。肌電電極被錨定在斜方肌中。使用不可吸收的6-0縫合線材料縫合頭皮。

睡眠評價

    電極放置手術(shù)兩周后，以500 Hz的采樣頻率記錄腦電圖和肌電圖。采用嚙齒動物睡眠評分軟件對清醒、REM或non REM（NREM）睡眠進行腦電圖和EMG記錄。REM期只有在≥1s長時才被考慮。由于電極放置而造成明顯腦損傷的對照組小鼠被排除在分析之外。

    另一組小鼠使用代謝表型系統(tǒng)進行72小時的睡眠/覺醒參數(shù)評估，預(yù)先編程的光周期和光亮度控制晝夜節(jié)律。如果小鼠有≥10分鐘沒有運動，則認為它們睡著了。

全身體積描記系統(tǒng)

     使用全身體積描記系統(tǒng)對小鼠進行連續(xù)4小時的評估，期間記錄呼吸，同時記錄其他不受限制、自由運動的小鼠的腦電圖。小鼠被放置在一個全身體積描記器中。這種方法提供了一種間接的潮氣量測量，它與密封腔室呼吸過程中產(chǎn)生的循環(huán)腔室壓力信號成正比。首先讓小鼠30 min適應(yīng)環(huán)境，然后持續(xù)記錄3小時數(shù)據(jù)。

 

動脈血氧飽和度測量

     使用MouseOx Plus小鼠脈搏血氧儀在室內(nèi)空氣或環(huán)境室內(nèi)記錄不受限制的清醒小鼠的動脈血氧飽和度。數(shù)據(jù)收集至少30 min，測量時儀器不能顯示錯誤代碼。然后對每只實驗條件的每只小鼠計算氧飽和度水平。

 

曠場實驗

     在一個正方形白色有機玻璃盒子（30 cm×30 cm）中進行30 min的曠場實驗。實驗箱被分為一個中心區(qū)（中心，15cm×15cm）和一個邊區(qū)（邊界）。使用攝像機記錄鼠標的運動，并使用視頻行為學(xué)系統(tǒng)軟件進行分析。以動物身體中心為參考點，計算總軌跡長度。

 

Y 迷宮

     Y迷宮由三個由有機玻璃組成的等距臂（120°，長35cm，寬10cm）組成。在訓(xùn)練期間，小鼠被放置在其中一只臂（開始臂）中進入另一只臂，持續(xù)15 min。訓(xùn)練后的一天，小鼠被允許在Y迷宮中探索10 min，并進入所有三個手臂。使用視頻行為學(xué)系統(tǒng)軟件對動物進行跟蹤，并分析在每只臂上花費的總時間和時間百分比。

新對象識別

     任務(wù)過程包括三個階段：適應(yīng)、熟悉化和測試階段。在適應(yīng)階段，小鼠被允許自由探索場地（40 cm×40cm）5 min。在熟悉階段，他們被放置在包含兩個相同樣本物體的場地，5 min，兩個物體都位于場地相對和對稱的角落。在1小時的記憶保留間隔后，小鼠和兩個物體放回到場地，一個與樣本相同，另一個為新物體，允許動物再次探索5 min。使用視頻行為學(xué)系統(tǒng)軟件跟蹤動物，并分析探索物體的時間百分比。

 

主動位置回避（Active place avoidance）

     該裝置由一個高架測試場組成，網(wǎng)格地板有一個透明的圓形邊界，側(cè)壁安裝視頻采集系統(tǒng)。測試場地順時針旋轉(zhuǎn)（1轉(zhuǎn)/分），電刺激可以通過網(wǎng)格地板傳遞。在適應(yīng)后的第二天，小鼠每天進行4或5天的訓(xùn)練，每天訓(xùn)練小鼠持續(xù)10 min，避免 60° 的電擊區(qū)，進入后導(dǎo)致短暫的足部電擊（500 ms，0.5 mA）。為了確定它們對電擊區(qū)的記憶，在最后一次訓(xùn)練結(jié)束24小時后，小鼠被允許在不施加電擊的情況下探索場地10 min。使用視頻行為學(xué)系統(tǒng)軟件跟蹤分析動物行為。

 

被動位置回避（Passive place avoidance）

      被動位置回避行為范式被用于測試基礎(chǔ)前腦依賴的idiothetic navigation（依賴于自身運動信息的導(dǎo)航，自我主張）。這個導(dǎo)航任務(wù)使用了與主動位置回避任務(wù)相同的設(shè)備。然而，所有的外部線索都被消除，以減少allothetic navigation（依賴于外界信息的導(dǎo)航策略，異源導(dǎo)航），圓形邊界是不透明的灰色，競技場在整個實驗過程中保持靜止。小鼠經(jīng)歷了5 min的適應(yīng)階段，然后是10 min的訓(xùn)練階段，訓(xùn)練階段間隔1小時。訓(xùn)練24小時后，小鼠被允許在電擊場不施加電擊探索5 min。

Morris水迷宮（Morris water maze）

     訓(xùn)練小鼠在水下1.5cm處找到一個平臺，在游泳時老鼠看不見它。每天進行3次試驗，每次60秒，試驗間隔30個min。在每次試驗中，小鼠以偽隨機的順序以三個指定的起點中的一個放入水箱中。如果老鼠在60秒內(nèi)未能找到平臺，它們會被手動引導(dǎo)到平臺，并允許在平臺停留至少20秒。小鼠根據(jù)需要被訓(xùn)練5天，以達到15s（逃避潛伏期）的訓(xùn)練標準。探索實驗安排在最后一次訓(xùn)練后24小時，包括一個沒有平臺的60秒試驗。使用視頻行為學(xué)系統(tǒng)軟件跟蹤測量動物游泳軌跡。

 

睡眠剝奪（Sleep deprivation）

     8只小鼠被放置在一個充滿水的睡眠剝奪箱（55cm×25cm）內(nèi)，籠子里有9個圓柱體（直徑3cm），離水面1cm。睡眠剝奪籠和對照籠（有圓柱體，但無水）被放在一個氣候室（27 °C ，25% RH，光照周期為12：12小時）里。小鼠被放置在睡眠剝奪籠子中20小時和普通飼養(yǎng)籠中4小時。飼養(yǎng)籠在光照周期中光照的4小時也放置在在氣候柜中。小鼠通過視頻進行監(jiān)測，并每天稱重。

Fig. 2: Urotensin II-SAPorin處理影響呼吸模式，在睡眠期間會誘發(fā)血氧不足。

     在清醒（A、B）或睡眠（C、D）期間注射對照空白SAP（A、C）或UII-SAP（B、D），采用全身體積描記記錄和對應(yīng)的EEG記錄下進行靜態(tài)呼吸測量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)是指對雄性和雌性小鼠的睡眠-覺醒配對雙向方差分析和Levene方差檢驗。

E UII-SAP組或?qū)φ战M空白-SAP組雄性小鼠的平均多導(dǎo)睡眠測量（睡眠-覺醒配對雙向方差分析）f頻率，PIF峰值吸氣流量，PEF峰值呼氣流量，EIP吸氣時間，EEP呼氣時間，RT：

F注射UII-SAP和空白SAP的雄性小鼠在睡眠期間的清醒活動狀態(tài)的平均血氧飽和度水平。

G 注射了UII-SAP或?qū)φ战M空白-SAP的雄性小鼠血氧飽和度水平的代表性趨勢圖。

    數(shù)據(jù)表明， cMPT損傷的小鼠在睡眠期間具有高度可變的呼吸模式，平均而言，這與由于上呼吸道阻力而發(fā)生的吸入和呼氣措施的預(yù)測改變相一致，呼吸對呼吸的變化表明了由缺氧引發(fā)的恢復(fù)反應(yīng)。大多數(shù)受損小鼠在睡眠中也表現(xiàn)出幾秒鐘的呼吸頻率下降，隨后是覺醒，這可以被解釋為呼吸暫停事件。此外，與最常見的SDB形式一致，在休息時，當(dāng) cMPT損傷小鼠在睡眠期間血氧測量30 min，發(fā)現(xiàn)血氧飽和度在80-90%左右，顯著低于空白小鼠的>95%（圖2F，G）。該結(jié)果表明， cMPT損傷影響呼吸模式，導(dǎo)致睡眠期間的輕度缺氧，這與氣道阻塞相一致。

 

Fig. 3: Urotensin II-saporin處理影響睡眠模式，導(dǎo)致睡眠不足。

A 在亮燈（睡眠）和不亮燈（清醒）期間，REM、NREM和清醒期的平均數(shù)量。

B在亮燈（睡眠）和不亮燈（清醒）期間，REM、NREM和清醒睡眠的平均次數(shù)。

C 在開燈（睡眠）和不亮燈（清醒）期間，REM、NREM和清醒睡眠的平均長度。

D損傷（灰色）和UTII-SAP（紅色）損傷小鼠在睡眠狀態(tài)和睡眠和清醒之間移動的平均轉(zhuǎn)換次數(shù)。E在活動記錄的前48小時內(nèi)，持續(xù)睡眠（持續(xù)至少10 min）的平均數(shù)量和時間和在12小時光照階段不活動的總時間

F在前48小時的12小時光期中不活動的總時間。

G一只對照組和一只受損傷的小鼠在12：12小時的光照：暗周期中超過3天的活動周期圖。在黑暗期的第3天，小鼠暴露于30 Lux昏暗的光線下3小時。

H實驗第3天12 h光期3h弱光期的活動時間。在注射UII-SAP（紫色）后2周開始的睡眠期2周內(nèi)，小鼠每天放置40%含氧（高氧o2）8小時，與注射UTII-SAP的小鼠相比，沒有睡眠不足。

 

Fig. 4:  cMPT損傷加重了APP/PS1小鼠的認知功能障礙。

A與熟悉（Fam）臂相比，在Y迷宮的新臂上花費的時間百分比。注射空白SAP的小鼠表現(xiàn)出對新臂的偏好，而 cMPT損傷的小鼠沒有偏好。

B Morris水迷宮訓(xùn)練階段的逃逸潛伏期。在過去兩天的訓(xùn)練中， cMPT損傷的APP/PS1小鼠尋找逃逸平臺的時間明顯更多。

C在Morris水迷宮的探索測試中到達平臺位置的潛伏期。兩組間的逃逸潛伏期無顯著性差異。

D主動位置回避試驗中每個訓(xùn)練日小鼠接受的電擊次數(shù)。cMPT損傷的APP/PS1小鼠在最后兩天接受了明顯更多的電擊。

E  cMPT損傷的APP/PS1小鼠所接受的電擊次數(shù)顯著高于非損傷的APP/PS1小鼠

 

Fig. 7: 睡眠剝奪會導(dǎo)致認知功能障礙，但不會導(dǎo)致AD的病理變化

A與熟悉的臂相比，在Y迷宮的新臂上花費的時間百分比。APP/PS1小鼠表現(xiàn)出對新臂的偏好，而睡眠剝奪的小鼠沒有偏好。

B C57Bl6小鼠在睡眠剝奪后的cBF神經(jīng)元數(shù)量與對照組小鼠相當(dāng)。

C海馬和皮質(zhì)裂解液中可溶性Aβ的量未因睡眠剝奪而改變。

D APP/PS1小鼠海馬和皮層的面積受年齡影響，但不受睡眠剝奪的影響。
 

HIF1α介導(dǎo)了 cMPT損傷后的cBF死亡

    為了測試cBF神經(jīng)元是否因暴露于慢性缺氧條件而死亡，野生型雄性小鼠在睡眠期間每天暴露于降低的（80%）的氧氣條件下8小時，持續(xù)4周。在這一時期，cBF神經(jīng)元的數(shù)量受到日常慢性缺氧沒有顯著不同的老鼠連續(xù)安置在常氧，表明慢性缺氧不能觸發(fā)相同的退行性途徑引起的 cMPT損傷。相比之下，慢性間歇性缺氧已被報道可誘導(dǎo)cBF神經(jīng)元變性。

 

Fig. 8: 間歇性缺氧可引起 cMPT損傷后的cBF神經(jīng)元丟失

A C67Bl6小鼠在每日睡眠時間內(nèi)每天在缺氧條件下暴露4周后的cBF神經(jīng)元數(shù)量。

B 在空白-SAP（灰色）或UII-SAP小鼠中，每日用15mg/kg2ME2（藍色）或載體（紅色）處理3周后，細胞核中存在HIF1α免疫染色的cBF神經(jīng)元的百分比。

C 4只動物的基底前腦切片的代表性共聚焦圖像，經(jīng)ChAT（紅色）、HIF1α（綠色）和細胞核（DAPI；藍色）免疫染色。注射Blank-SAP（灰色）或UII-SAP，每天用15mg/kg2ME2（藍色）或載體（紅色）

D,E 處理3周后，小鼠cLDT (D)和cBF (E)神經(jīng)元的數(shù)量。2ME2治療可保護cBF神經(jīng)元免受損傷的影響。

F 在被動位置回避任務(wù)的測試階段，2ME2處理（藍色條）和未處理的UII-SAP損傷（紅色條）小鼠與空白SAP損傷小鼠（灰色條）的表現(xiàn)。

G UII-SAP注射的ChAT-cre HIF-1αfl/wt小鼠的cBF神經(jīng)元數(shù)量與空白-SAP注射的ChAT-cre HIF-1αfl/wt小鼠無顯著差異。
 

預(yù)防缺氧可預(yù)防 cMPT損傷后的AD特征

    人類患者阻塞性睡眠呼吸暫停的標準治療是在睡眠期間使用持續(xù)氣道正壓（CPAP）治療，這是在物理上維持氣道開放，從而防止血氧飽和度下降和睡眠喚醒。為了驗證對SDB小鼠在高氧環(huán)境下的睡眠階段進行治療是否可以保護cBF神經(jīng)元免受 cMPT損傷誘導(dǎo)的細胞死亡和/或Aβ積累。

    研究團隊使用高氧（40%）環(huán)境，將 cMPT損傷小鼠在睡眠階段的血氧水平恢復(fù)到>為95%的spo2。從病變手術(shù)后2周開始，年老的APP/PS1小鼠在12小時睡眠期間每天接受高氧治療，持續(xù)4周。該治療對 cMPT病變的范圍沒有影響。

    然而，APP/PS1中cBF神經(jīng)元的數(shù)量（圖9b；和野生型圖3E）高氧處理的 cMPT損傷動物明顯高于未處理的損傷小鼠，與標準飼養(yǎng)籠中的假損傷動物相似（圖9B），從而證實了cBF變性是SDB表型的結(jié)果。

此外，在損傷的APP/PS1隊列中，每日高氧治療顯著降低了淀粉樣蛋白病理程度（圖9C、E）和炎癥程度（圖9F-H）。

 

Fig. 9: 高氧治療可防止OSA加重AD表型

APP/PS1小鼠注射UII-SAP并經(jīng)常氧或高氧處理后，

cLDT (A)和cBF (B)神經(jīng)元的數(shù)量

新皮質(zhì)中硫黃素-s陽性Aβ斑塊的數(shù)量（C）和面積（D）。

新皮質(zhì)中GFAP陽性小膠質(zhì)細胞的密度（E）和面積（F）。

新皮質(zhì)中cd68陽性星形膠質(zhì)細胞的密度（G）和面積（H）。
 

   睡眠呼吸障礙會導(dǎo)致睡眠期間大腦缺氧，大腦缺氧會導(dǎo)致神經(jīng)元的選擇性退化，而這些退化神經(jīng)元，通常會在癡呆癥中死亡。當(dāng)研究人員剝奪小鼠睡眠時，并沒有發(fā)現(xiàn)引起與這種睡眠呼吸障礙相同的病理特征，即便是睡眠剝奪確實會損害記憶。研究人員認為，睡眠呼吸暫停似乎是導(dǎo)致阿爾茨海默氏癥發(fā)展的風(fēng)險因素。

  “目前還沒有有效逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病的方法，因此預(yù)防疾病的發(fā)生就顯得尤為重要。這就需要我們了解哪些原因能導(dǎo)致特發(fā)性疾病的發(fā)生。”錢磊博士指出，“睡眠呼吸障礙是癡呆癥發(fā)生的一個重要的流行病學(xué)風(fēng)險因素，與發(fā)病年齡提前、認知能力下降增快有關(guān)。我們的工作為這種流行病學(xué)聯(lián)系提供了機制，也對識別高危人群具有重要意義。”

    Elizabeth Coulson教授表示：“下一步我們將利用已有的動物模型，研究在睡眠呼吸障礙過程中，參與基底前腦膽堿能神經(jīng)元病變的分子通路，并尋找潛在的候選分子阻止上述病變發(fā)生。此外，一項關(guān)聯(lián)睡眠呼吸障礙、MRI腦成像與癡呆癥的臨床試驗也在進行，進一步確認對睡眠呼吸障礙的干預(yù)是否能延緩或阻止癡呆癥的發(fā)生。”

Qian, L., Rawashdeh, O., Kasas, L. et al. Cholinergic basal forebrain degeneration due to sleep-disordered breathing exacerbates pathology in a mouse model of Alzheimer’s disease. Nat Commun 13, 6543 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33624-y
 

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