Innopsys熒光掃描儀在單細(xì)胞western blots檢測中的應(yīng)用

細(xì)胞是生命體最小的組成單位，蛋白質(zhì)是生命活動的執(zhí)行者，而細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)豐度的變化對各種生命過程有著至關(guān)重要的作用，不僅為生命活動提供物質(zhì)基礎(chǔ)，也是理解細(xì)胞功能和發(fā)展過程的中心環(huán)節(jié)。細(xì)胞在生長過程中，經(jīng)過多次分裂增殖，在完成其生命周期的同時(shí)也會呈現(xiàn)分子生物學(xué)或基因方面的改變，從而產(chǎn)生細(xì)胞多樣性即細(xì)胞異質(zhì)性，這是一種普遍存在的生物學(xué)現(xiàn)象，即使看起來相同的細(xì)胞，也可能存在顯著的差異。而傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)是對組織或大量細(xì)胞樣本進(jìn)行分析，獲得的是均質(zhì)化后的結(jié)果，掩蓋了單個(gè)細(xì)胞的個(gè)體差異，而在組織、器官或個(gè)體中，細(xì)胞具有非常大的異質(zhì)性，傳統(tǒng)的研究方法不能完全衡量細(xì)胞的復(fù)雜性、多樣性以及功能差異。同時(shí)基于流式的檢測技術(shù)，由于很難檢測細(xì)胞胞內(nèi)的蛋白水平以及抗體來源受限，使得這一方法有一定的局限性。

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)研究早已進(jìn)入了單細(xì)胞時(shí)代，在mRNA水平已經(jīng)可以很好的從單細(xì)胞的維度上探究細(xì)胞、組織、器官的發(fā)育過程以及與疾病相關(guān)的細(xì)胞異質(zhì)性和同質(zhì)性問題。但由于基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平相關(guān)性并不是很高，也不能完全反映蛋白質(zhì)的調(diào)控作用，所以要更好地理解細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，檢測效應(yīng)分子蛋白質(zhì)比mRNA更直接有效，對于理解細(xì)胞的功能更為重要。近幾年，基于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組技術(shù)的方法快速發(fā)展，在很大程度上彌補(bǔ)了單細(xì)胞水平蛋白質(zhì)研究的需求。
 

本文主要介紹一種單細(xì)胞蛋白免疫印跡檢測技術(shù)(Single cell Westerns Blotting, scWesterns)，是對傳統(tǒng)的蛋白免疫印跡(Western blotting)方法的精細(xì)化改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了在單細(xì)胞層面上高通量的對于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行免疫印跡檢測、定量和分析，與傳統(tǒng)的western blots不同，scWesterns方法可以精確量化由外界刺激所引起的單個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)水平的變化。系統(tǒng)組成：scWesterns 檢測試劑、全自動電泳分離系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理軟件以及Innopsys芯片掃描儀，檢測流程如圖(一)所示。scWesterns實(shí)驗(yàn)整個(gè)過程都是在改造的顯微鏡載玻片上進(jìn)行的，載玻片上有通過軟光刻技術(shù)制作而成的可以固定單個(gè)細(xì)胞的凝膠槽矩陣，每個(gè)微孔都可以看作是一個(gè)微型的反應(yīng)器，對細(xì)胞矩陣進(jìn)行明場光學(xué)掃描之后，將凝膠槽轉(zhuǎn)移至微型電泳槽中，進(jìn)行蛋白凝膠電泳。整個(gè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)高通量的對單細(xì)胞蛋白進(jìn)行scWesterns檢測和分析。
 

操作流程圖一：1.解凍細(xì)胞，吹打混勻，離心重懸制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為 10,000 - 100,000 個(gè)細(xì)胞/mL，種植細(xì)胞，將 1 mL 單細(xì)胞懸液從左到右滴加到芯片上，確保整張芯片都被均勻覆蓋，細(xì)胞在重力的作用下會沉降到光敏膠中，室溫靜置 5-20 分鐘，用明場顯微鏡觀察芯片,確保每個(gè)block至少有15%-20%細(xì)胞占有率，且很少存在單孔雙細(xì)胞的狀態(tài)；2.在儀器電泳槽中加入300uL裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，根據(jù)蛋白大小設(shè)置參數(shù)運(yùn)行儀器進(jìn)行電泳分離和蛋白固定；3.稀釋不同種屬的一抗（小鼠，山羊，兔）與芯片進(jìn)行雜交，室溫孵育 1-2小時(shí)，也可4度過夜，孵育后用wash buffer清洗三次，每次10分鐘；稀釋二抗，芯片避光與二抗孵育1小時(shí)，孵育后用wash buffer清洗三次，每次10分鐘，最后用去離子水連續(xù)沖洗芯片1分鐘；4.使用Innopsys 1100三色熒光掃描儀（紅、綠、藍(lán)）進(jìn)行熒光信號掃描；5-6.使用分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
 

結(jié)果顯示：采用scWesterns技術(shù)對單細(xì)胞進(jìn)行四個(gè)靶蛋白檢測，如圖二所示，根據(jù)不同蛋白分子量的差異以及雜交不同種屬的一抗和熒光二抗來區(qū)分不同的靶標(biāo)蛋白，使用Innopsys 1100對紅、綠、藍(lán)三種熒光信號進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對刺激產(chǎn)生了ERK應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)檢測到了EGFR表皮生長因子受體、以及突變體L858R。
 

圖二：對紅，綠，藍(lán)不同熒光標(biāo)記的目的蛋白（ERK，EGFR,L858R,Tubulin）進(jìn)行檢測，結(jié)果如上圖所示。
 

展望：scWesterns技術(shù)可以應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括腫瘤細(xì)胞：腫瘤的耐藥基礎(chǔ)研究，惡性腫瘤標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)；免疫細(xì)胞：機(jī)體免疫狀態(tài)分析以及免疫應(yīng)答基礎(chǔ)研究；干細(xì)胞：干細(xì)胞分化發(fā)育研究，精準(zhǔn)控制干細(xì)胞分化發(fā)育；藥物研發(fā)：量化細(xì)胞對藥物制劑的反應(yīng)。

Innopsys 成立于1999年�？偛课挥诜▏�，一直致力于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)儀器和軟件的自主研發(fā)和生產(chǎn)。Innoscan系列掃描儀，采用先進(jìn)的共聚焦PMT檢測器和多激光掃描光路，可以同時(shí)進(jìn)行多通道熒光檢測。不僅有效降低了熒光光漂白現(xiàn)象以及信號損失，還可以有效縮短掃描時(shí)間。在基因組和蛋白組表達(dá)，基因突變，SNP檢測，CGH，細(xì)菌病毒檢測，腫瘤特異性標(biāo)志篩查，病理組織篩查等方面都有非常廣泛的應(yīng)用。

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