DAP-seq技術(shù)在ABA信號(hào)調(diào)控水稻適應(yīng)非生物脅迫機(jī)制研究中的應(yīng)用
近日，中科院植物所王雷研究組在Plant Physiology期刊上發(fā)表了題為“Rice CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1 transcriptionally regulates ABA signaling to confer multiple abiotic stress tolerance”的研究成果。該研究揭示了OsCCA1調(diào)控水稻適應(yīng)鹽脅迫、干旱脅迫以及滲透脅迫的分子機(jī)制。其中，該研究使用了DNA親和純化測(cè)序技術(shù)（DAP-seq，DNA Affinity Purification Sequencing），鑒定了水稻生物鐘核心組分OsCCA1（Oryza sativa CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）調(diào)控的下游靶基因。
研究背景
生物鐘組分和脫落酸（Abscisic Acid，ABA）在調(diào)控植物生長發(fā)育和適應(yīng)逆境脅迫過程中具有重要作用，但生物鐘組分是否參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前還不清楚。
研究材料
野生型水稻材料Dongjin（DJ）和OsCCA1功能缺失的突變體水稻（oscca1-L1和oscca1-L2）
研究結(jié)果
圖1. 使用DAP-seq方法，在全基因組水平上鑒定OsCCA1的直接結(jié)合靶點(diǎn)。
A. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關(guān)聯(lián)的基因數(shù)量及在全基因組的分布圖。
B. 使用MEME-CHIP分析OsCCA1結(jié)合的motif。
C和D. 使用EMSA驗(yàn)證OsCCA1與SRZ1基因和OsPP2C09基因啟動(dòng)子區(qū)的AAATATC motif的結(jié)合。
E. 使用DAP-seq鑒定的OsCCA1關(guān)聯(lián)基因KEGG富集結(jié)果。
圖2. 使用RNA-seq發(fā)現(xiàn)OsCCA1調(diào)節(jié)ABA響應(yīng)基因的表達(dá)。
A. oscca1-L1突變體與Dongjin (DJ)相比，上調(diào)和下調(diào)基因的數(shù)量。
B. 鹽脅迫條件下oscca1-L1中DEGs富集最多的15個(gè)GO term。
C. oscca1-L1突變體中DEGs與ABA響應(yīng)基因重疊的基因數(shù)量。紅色和藍(lán)色箭頭分別表示上調(diào)和下調(diào)的基因。
D. 熱圖顯示（C）中19個(gè)ABA響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄豐度。
E. 鹽脅迫下oscca1-L1中的DEGs重疊的OsPYLs基因（左）、A類OsPP2Cs基因（中）、SnRKs/SAPKs基因（右）。紅色和藍(lán)色箭頭分別代表表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因。
圖3. OsCCA1直接調(diào)控ABA響應(yīng)基因的表達(dá)。
A. 比較DAP-seq鑒定的靶基因與RNA-seq結(jié)果中，oscca1突變體中已鑒定的DEGs，將重合的基因作為OsCCA1的直接靶基因。
B. OsCCA1靶基因的前15個(gè)富集的GO term。
C. OsCCA1直接激活的靶基因與A類OsPP2C基因重疊的基因。oscca1突變體與DJ中5個(gè)重疊基因的轉(zhuǎn)錄豐度。
D. 通過DAP-seq檢測(cè)的OsCCA1在OsPP108p（-2625 bp）上結(jié)合峰（重復(fù)1和重復(fù)2）和陰性對(duì)照（mock）。
E. OsbZIP46是OsCCA1的靶基因，而且是OsCCA1突變體中下調(diào)基因和鹽脅迫反應(yīng)基因中唯一的基因。
F. 通過DAP-seq檢測(cè)到的OsCCA1在OsbZIP46（-1263 bp）上結(jié)合峰(重復(fù)1和重復(fù)2)和陰性對(duì)照（mock）。
圖4. OsCCA1直接結(jié)合OsPP108和OsbZIP46的啟動(dòng)子，并激活其轉(zhuǎn)錄。
A. 在正常條件和NaCl處理24小時(shí)后，Dongjin (DJ)和oscca1-Ls植株中OsPP108(左)和OsbZIP46(右)的轉(zhuǎn)錄水平。
B. 水稻原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，OsCCA1可激活OsPP108和OsbZIP46的轉(zhuǎn)錄活性。
C和D. ChIP-qPCR檢測(cè)顯示OsCCA1結(jié)合OsPP108和OsbZIP46的啟動(dòng)子。
E和F. EMSA結(jié)果顯示OsCCA1直接結(jié)合OsPP108和OsbZIP46啟動(dòng)子的rCBS基序。
結(jié)論
本研究使用DAP-seq和RNA-seq方法，揭示了水稻生物鐘核心組分OsCCA1通過直接結(jié)合和調(diào)控OsPP2Cs和OsbZIP46基因來協(xié)調(diào)ABA信號(hào)網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)水稻對(duì)多種非生物脅迫適應(yīng)性的分子機(jī)制。該研究為生物鐘調(diào)控水稻耐逆性提供了新的理論依據(jù)，為研發(fā)具有多重抗逆性的水稻品種提供了設(shè)計(jì)育種的靶點(diǎn)和優(yōu)質(zhì)遺傳資源。
DAP-seq高通量地鑒定轉(zhuǎn)錄因子在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，預(yù)測(cè)下游基因。藍(lán)景科信擁有100+物種，1000+轉(zhuǎn)錄因子的DAP-seq實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)。我們使用該技術(shù)已助力客戶在許多期刊發(fā)表文章，例如：Molecular Plant，The Plant Cell，Plant Physiology，Plant Biotechnology Journal，Journal of Integrative Plant Biology，New Phytologist等。
