DAP-seq技術(shù)在金銀花綠原酸生物合成和苯丙素代謝機(jī)制研究中的應(yīng)用

綠原酸(CGA)是灰氈毛忍冬(Lonicera macranthoides，別稱：金銀花)最重要的活性藥物成分，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)μ烊籆GA的需求急劇增長(zhǎng)。雖然CGA生物合成的關(guān)鍵基因已有報(bào)道，但其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制在很大程度上仍然是未知的。因此，研究CGA生物合成的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)于利用基因工程技術(shù)培育高CGA含量的金銀花新品種具有重要意義。

2021年4月29日，重慶文理學(xué)院園林與生命科學(xué)學(xué)院陳澤雄教授的研究成果，發(fā)表在植物科學(xué)領(lǐng)域的知名學(xué)術(shù)期刊Plant Science上，文章題目為“A R2R3-MYB transcriptional activator LmMYB15 regulates chlorogenic acid biosynthesis and phenylpropanoid metabolism in Lonicera macranthoides”，該期刊的影響因子為5.363。該研究使用DNA親和純化測(cè)序(DAP-seq) 技術(shù)鑒定了金銀花R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子LmMYB15的DNA結(jié)合基序及其靶基因。進(jìn)一步研究揭示了LmMYB15調(diào)控金銀花CGA生物合成和苯丙素代謝的分子機(jī)制，該研究成果為利用基因工程策略開發(fā)富含CGA的金銀花新品種提供了寶貴的基因資源。

該研究首先通過對(duì)金銀花不同發(fā)育時(shí)期的不同組織進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)和轉(zhuǎn)錄圖譜分析，發(fā)現(xiàn)LmMYB3、LmMYB4、LmMYB15和LmMYB31基因與CGA的含量存在顯著的相關(guān)性，表明這些基因在調(diào)控CGA生物合成中發(fā)揮潛在作用。LmMYB15和其他MYBs蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，LmMYB15與紅花CtMYB1、擬南芥AtMYB15和AtMYB14、番茄SlMYB15和菊花CmMYB15具有相近的同源性。酵母雙雜交試驗(yàn)表明LmMYB15可作為轉(zhuǎn)錄激活因子。在煙草中過表達(dá)LmMYB15基因，促使CGA的含量顯著增加，表明LmMYB15是CGA生物合成的正調(diào)控因子。

圖1. DAP-seq分析鑒定全基因組范圍的LmMYB15靶基因

(A) LmMYB15結(jié)合的peaks在基因組上的分布分析。(B) 通過MEME-Chip分析篩選LmMYB15的DNA結(jié)合基序，其中(C/T) (C/T) (C/T) ACCTA(C/A) (C/T) (A/T) (即YYYACCTAMYW) 和 (C/T)ACCTA(C/A)(即YACCTAM)為最集中富集的2個(gè)基序。

為了闡明LmMYB15的分子機(jī)制，采用DAP-seq技術(shù)鑒定了LmMYB15的DNA結(jié)合基序及其直接的下游靶基因，包括4CL、MYB3、MYB4、KNAT6/7、IAA26和ETR2等。酵母單雜交和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，LmMYB15可以結(jié)合4CL、MYB3和MYB4的啟動(dòng)子，并激活這些基因的表達(dá)，從而促進(jìn)CGA的生物合成和苯丙素代謝。該研究揭示了一種LmMYB15調(diào)控金銀花CGA生物合成的新的分子機(jī)制，同時(shí)為高CGA含量的金銀花育種策略提供了新途徑，這對(duì)于提高金銀花的藥用性能具有重要意義。

圖2. LmMYB15正向調(diào)控CGA生物合成的分子機(jī)制模式圖

總結(jié)：該研究從金銀花中分離到一個(gè)R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子LmMYB15，它是CGA生物合成的正調(diào)控因子，它直接與下游靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，包括4CL、MYB3和MYB4，從而促進(jìn)CGA的積累和苯丙素代謝。該研究為CGA生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了新見解，同時(shí)為培育具有更高藥用價(jià)值的高CGA含量金銀花新品種提供了新的策略。