實(shí)時(shí)活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像技術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用
免疫反應(yīng)是由多種細(xì)胞類型參與的一個(gè)受嚴(yán)格調(diào)控的過程，旨在保護(hù)身體免受微生物、毒素的侵害以及避免腫瘤的形成。全球各地的研究人員旨在更深入地了解這些過程，以理解癌癥、自身免疫性疾病、炎癥、過敏和病毒感染背后的機(jī)制。實(shí)時(shí)活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像技術(shù)正是一種為此提供全面數(shù)據(jù)的寶貴工具。
本文中，我們使用了新一代活細(xì)胞成像系統(tǒng)CELLCYTE X來解決免疫學(xué)中的不同問題：觀察不同類型免疫細(xì)胞的形態(tài)和增殖狀態(tài)，記錄巨噬細(xì)胞分化過程中的生長行為，進(jìn)一步討論了CELLCYTE X如何用于分析細(xì)胞死亡期間的免疫細(xì)胞健康狀況（一種防止免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)的反饋機(jī)制），以及利用它來評(píng)估細(xì)胞免疫療法（如CAR- T療法），以根除癌癥細(xì)胞，從而為免疫學(xué)研究提供有效的解決方法。
新一代活細(xì)胞成像系統(tǒng) CELLCYTE X
材料與方法
1. 細(xì)胞培養(yǎng)
將Jurkat、Nalm-6和THP-1細(xì)胞在有10%胎牛血清（FBS）（Sigma）和1%青霉素/鏈霉素（P/S）（Thermo Fisher）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher）中，在37°C和5%CO2下培養(yǎng)。每周傳代兩次，接種用于如下所述研究。
2. 免疫細(xì)胞增值研究
將Jurkat、Nalm-6和THP-1細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)并以所示細(xì)胞數(shù)（2.5k、5k、10k、20k、40k/孔）接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，#3595）中。細(xì)胞在室溫下沉淀30min，以確保細(xì)胞在整個(gè)孔中均勻分布。隨后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中的CELLCYTE X中觀測(cè)。使用10X鏡頭標(biāo)準(zhǔn)掃描模塊每2小時(shí)掃描一次，監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長持續(xù)96小時(shí)。使用CELLCYTE Studio中的細(xì)胞融合模塊分析細(xì)胞生長情況（圖1）。
3. 巨噬細(xì)胞分化研究
將THP-1單核細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)并以每孔10k個(gè)細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將12-myristate 13-acetate (PMA) (PeproTech) 以1mg/mL溶解在DMSO中，并將其添加到孔中以獲得5ng/mL、50ng/mL或500ng/mL的最終濃度。濃度為2.5µg/µL 的Lipopolysaccharide（LPS）（Thermo Fisher）作為即用溶液添加到細(xì)胞中，以在孔中獲得10ng/µL、100ng/µL.或1000ng/µL的最終濃度。對(duì)照細(xì)胞不做處理。使用10X標(biāo)準(zhǔn)掃描模塊每3小時(shí)對(duì)細(xì)胞成像，持續(xù)96小時(shí)。使用CELLCYTE Studio中的細(xì)胞融合模塊分析細(xì)胞生長情況（圖2）。
4. 活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡研究
將Jurkat細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)并以每孔10k個(gè)細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。加入C.LIVE Tox Green（1 mM in DMSO）（CYTENA，CY.CL.KIT.002，此染料只能進(jìn)入失去膜完整性的死細(xì)胞，當(dāng)它與DNA結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)出綠色熒光，從而提供有價(jià)值的細(xì)胞死亡實(shí)時(shí)讀數(shù)）以在孔中獲得250nM的最終濃度。將Ionomycin （Cayman）溶于DMSO中以獲得1mg/mL的儲(chǔ)備濃度。Jurkat細(xì)胞在有或無10ng/mL PMA和750ng/mL Ionomycin （1X）或其稀釋液（0.5X，0.25X，0.125X，0.0625X）的組合下生長。使用CELLCYTE X 10X標(biāo)準(zhǔn)掃描模塊每3小時(shí)監(jiān)測(cè)一次Jurkat細(xì)胞的生長和健康狀況，持續(xù)96小時(shí)，并對(duì)融合與綠色熒光計(jì)數(shù)進(jìn)行量化（圖3）。
5. 細(xì)胞免疫療法研究
此細(xì)胞免疫療法研究與弗賴堡大學(xué)CIBSS與BIOSS研究中心的Susana Minguet博士研究小組合作進(jìn)行。將Nalm-6細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)并以每孔20k個(gè)細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將CYTENA的C.LIVE Caspase-3 Green NucView（5 mM，溶解在DMSO中）添加到細(xì)胞中，在孔中獲得2.5µM的最終濃度。CAR-T細(xì)胞的產(chǎn)生如下文所述。將CAR-T細(xì)胞以1:1或3:1的效靶比添加到Nalm-6細(xì)胞中，并使用10X標(biāo)準(zhǔn)掃描模塊的CELLCYTE X每小時(shí)監(jiān)測(cè)共培養(yǎng)，持續(xù)12小時(shí)。使用CELLCYTE Studio中的目標(biāo)對(duì)象計(jì)數(shù)模塊對(duì)C.LIVE Caspase-3的總強(qiáng)度進(jìn)行量化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 免疫細(xì)胞生長和增殖
來自CELLCYTE X的增強(qiáng)輪廓圖像顯示：THP-1細(xì)胞體積比其他免疫細(xì)胞系相對(duì)較大，并且在細(xì)胞懸液中它們往往以單細(xì)胞的形式生長。Jurkat細(xì)胞相對(duì)較小，主要以懸浮細(xì)胞簇的形式生長。Nalm-6細(xì)胞的細(xì)胞大小與Jurkat細(xì)胞大致相同，但在懸浮液中以單細(xì)胞形式生長（圖1A）。這些觀察結(jié)果已在文獻(xiàn)中得到證實(shí)（1）。隨著時(shí)間的推移，三種細(xì)胞系的生長被量化并顯示出穩(wěn)定增殖（圖1B）。和預(yù)期的一樣，播種密度更高的孔更快達(dá)到完全匯合。此外，還注意到Jurkat細(xì)胞在觀察到的時(shí)間范圍內(nèi)沒有達(dá)到完全融合，這是因?yàn)樗鼈兪亲鳛榧?xì)胞簇生長。總之，CELLCYTE X及其可靠的自動(dòng)聚焦可以對(duì)懸浮液中不同生長形態(tài)的免疫細(xì)胞連續(xù)成像，實(shí)時(shí)分析細(xì)胞增殖，提供細(xì)胞生長的全面數(shù)據(jù)。
來自CELLCYTE Studio中的細(xì)胞融合模塊分析顯示：隨著時(shí)間的推移PMA處理的THP-1細(xì)胞改變了它們的形態(tài)，細(xì)胞質(zhì)體積顯著增加導(dǎo)致了細(xì)胞體積增大，并且細(xì)胞也開始粘附在細(xì)胞培養(yǎng)板上（圖2A和B），在此觀察到的變化與巨噬細(xì)胞分化與核質(zhì)比率降低和細(xì)胞粘附增加相關(guān)的研究一致（2，3）。此外，與未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞相比，隨著時(shí)間的推移細(xì)胞融合減少，表明細(xì)胞增殖減少（圖2C）。
CELLCYTE X允許對(duì)分化過程進(jìn)行全面的理解，因?yàn)樵诹炕诤系耐瑫r(shí)提供視覺洞察力。它通過劇烈的形態(tài)學(xué)變化來跟蹤整個(gè)過程，從而準(zhǔn)確測(cè)量免疫細(xì)胞對(duì)不同刺激的反應(yīng)。LPS刺激THP-1細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致形態(tài)變化（圖2A和B），也不會(huì)影響細(xì)胞增殖（圖2C）。這一觀察結(jié)果得到了文獻(xiàn)的證實(shí)（4，5）。
3. 激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
CELLCYTE X 成像顯示：在96小時(shí)的過程中，用PMA和離子霉素的組合刺激顯著減少了細(xì)胞增殖，未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞隨著時(shí)間的推移顯示出預(yù)期的匯合（圖3A和B）。此外，PMA/離子霉素處理的細(xì)胞顯示出死亡細(xì)胞的增加，這種效應(yīng)可以以劑量依賴的方式觀察到。對(duì)照細(xì)胞僅顯示出少量的細(xì)胞死亡，尤其是在細(xì)胞高度融合的后期（圖3C）。這些觀察結(jié)果表明，用PMA和離子霉素治療確實(shí)會(huì)引發(fā)活性誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡（AICD），正如之前的其他研究所表明的那樣，這些研究認(rèn)為PMA可以激活蛋白激酶C，而鈣離子載體離子霉素可以提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平，從而導(dǎo)致數(shù)種模擬TCR激活的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活，并導(dǎo)致AICD。（6）
在此項(xiàng)研究中，CELLCYTE X促進(jìn)了動(dòng)態(tài)量化，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)治療效果。CYTENA的C.LIVE Tox試劑允許在AICD過程中直接檢測(cè)死細(xì)胞。除了自動(dòng)圖像分析之外，用戶還可以通過基于圖像的方法監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)，以獲得細(xì)胞死亡過程的詳細(xì)見解。
4. 激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
綠色C.LIVE Caspase-3染料總熒光強(qiáng)度顯示，單獨(dú)培養(yǎng)的Nalm-6靶細(xì)胞和CAR-T效應(yīng)細(xì)胞以單細(xì)胞形式生長，且只有少量細(xì)胞發(fā)生凋亡。相反，Nalm-6細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞的共培養(yǎng)產(chǎn)生細(xì)胞簇，并在12小時(shí)的時(shí)間過程中顯示出綠色總熒光強(qiáng)度的顯著增加，這表明CAR-T細(xì)胞可以識(shí)別并殺死Nalm-6細(xì)胞。
使用CELLCYTE X能夠?qū)^程進(jìn)行詳細(xì)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。觀察到的殺傷效果取決于效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例，這是由于更高數(shù)量CAR-T細(xì)胞顯示出更高的總熒光強(qiáng)度，這表明靶細(xì)胞的殺傷更有效、更早。此外，每小時(shí)掃描可以全面實(shí)時(shí)記錄這些快速免疫細(xì)胞殺傷過程。用CELLCYTE X進(jìn)行的觀察結(jié)果與將CD19導(dǎo)向的CAR - T細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性腫瘤非常有效的研究相一致。（7）
活細(xì)胞成像技術(shù)在免疫學(xué)應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)
德國Cytena開發(fā)的CELLCYTE X 新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)可內(nèi)置在任何品牌型號(hào)的CO2培養(yǎng)箱中，對(duì)正常培養(yǎng)中的細(xì)胞做長時(shí)間實(shí)時(shí)24小時(shí)循環(huán)拍攝成像，監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長變化狀態(tài)，并對(duì)其進(jìn)行功能分析，輸出隨時(shí)間變化曲線、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)圖片、過程影像等數(shù)據(jù)結(jié)果。在免疫學(xué)應(yīng)用中，它有以下優(yōu)勢(shì)：
參考文獻(xiàn)
1. Components of the Immune System. Primer to the Immune Response. Elsevier; 2014: 21-54. DOI:10.1016/B978-0-12-385245-8.00002-9
2. Daigneault M, Preston JA, Marriott HM, et al. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 2010; 5(1): e8668. DOI:10.1371/journal.pone.0008668
3. 1Pinto SM, Kim H, Subbannayya Y, et al. Comparative proteomic analysis reveals varying impact on immune responses in phorbol 12-myristate-13-acetate-mediated THP-1 monocyte-to-macrophage differentiation. Frontiers in Immunology. 2021; 12. DOI:10.3389/fimmu.2021.679458
4. Widdrington JD, Gomez-Duran A, Pyle A, et al. Exposure of monocytic cells to lipopolysaccharide induces coordinated endotoxin tolerance, mitochondrial biogenesis, mitophagy, and antioxidant defenses. Frontiers in Immunology. 2018; 9. DOI:10.3389/fimmu.2018.02217
5. Tucureanu MM, Rebleanu D, Constantinescu CA, et al. Lipopolysaccharide-induced inflammation in monocytes/macrophages is blocked by liposomal delivery of Gi-protein inhibitor. International Journal of Nanomedicine. 2018; 13: 63-76. DOI:10.2147/IJN.S150918
6. Ai W, Li H, Song N, Li L, Chen H. Optimal method to stimulate cytokine production and its use in immunotoxicity assessment. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2013; 10(9): 3834-3842. DOI:10.3390/ijerph10093834
7. Abramson JS. Anti-CD19 CAR T-cell therapy for B-cell non-hodgkin lymphoma. Transfusion Medicine Reviews. 2020; 34(1): 29-33. doi:10.1016/j.tmrv.2019.08.003
本文中，我們使用了新一代活細(xì)胞成像系統(tǒng)CELLCYTE X來解決免疫學(xué)中的不同問題：觀察不同類型免疫細(xì)胞的形態(tài)和增殖狀態(tài)，記錄巨噬細(xì)胞分化過程中的生長行為，進(jìn)一步討論了CELLCYTE X如何用于分析細(xì)胞死亡期間的免疫細(xì)胞健康狀況（一種防止免疫系統(tǒng)過度反應(yīng)的反饋機(jī)制），以及利用它來評(píng)估細(xì)胞免疫療法（如CAR- T療法），以根除癌癥細(xì)胞，從而為免疫學(xué)研究提供有效的解決方法。
新一代活細(xì)胞成像系統(tǒng) CELLCYTE X
材料與方法
1. 細(xì)胞培養(yǎng)
將Jurkat、Nalm-6和THP-1細(xì)胞在有10%胎牛血清（FBS）（Sigma）和1%青霉素/鏈霉素（P/S）（Thermo Fisher）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo Fisher）中，在37°C和5%CO2下培養(yǎng)。每周傳代兩次，接種用于如下所述研究。
2. 免疫細(xì)胞增值研究
將Jurkat、Nalm-6和THP-1細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)并以所示細(xì)胞數(shù)（2.5k、5k、10k、20k、40k/孔）接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，#3595）中。細(xì)胞在室溫下沉淀30min，以確保細(xì)胞在整個(gè)孔中均勻分布。隨后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中的CELLCYTE X中觀測(cè)。使用10X鏡頭標(biāo)準(zhǔn)掃描模塊每2小時(shí)掃描一次，監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長持續(xù)96小時(shí)。使用CELLCYTE Studio中的細(xì)胞融合模塊分析細(xì)胞生長情況（圖1）。
3. 巨噬細(xì)胞分化研究
將THP-1單核細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)并以每孔10k個(gè)細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。將12-myristate 13-acetate (PMA) (PeproTech) 以1mg/mL溶解在DMSO中，并將其添加到孔中以獲得5ng/mL、50ng/mL或500ng/mL的最終濃度。濃度為2.5µg/µL 的Lipopolysaccharide（LPS）（Thermo Fisher）作為即用溶液添加到細(xì)胞中，以在孔中獲得10ng/µL、100ng/µL.或1000ng/µL的最終濃度。對(duì)照細(xì)胞不做處理。使用10X標(biāo)準(zhǔn)掃描模塊每3小時(shí)對(duì)細(xì)胞成像，持續(xù)96小時(shí)。使用CELLCYTE Studio中的細(xì)胞融合模塊分析細(xì)胞生長情況（圖2）。
4. 活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡研究
5. 細(xì)胞免疫療法研究
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1. 免疫細(xì)胞生長和增殖
2. 單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化
CELLCYTE X允許對(duì)分化過程進(jìn)行全面的理解，因?yàn)樵诹炕诤系耐瑫r(shí)提供視覺洞察力。它通過劇烈的形態(tài)學(xué)變化來跟蹤整個(gè)過程，從而準(zhǔn)確測(cè)量免疫細(xì)胞對(duì)不同刺激的反應(yīng)。LPS刺激THP-1細(xì)胞不會(huì)導(dǎo)致形態(tài)變化（圖2A和B），也不會(huì)影響細(xì)胞增殖（圖2C）。這一觀察結(jié)果得到了文獻(xiàn)的證實(shí)（4，5）。
3. 激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
在此項(xiàng)研究中，CELLCYTE X促進(jìn)了動(dòng)態(tài)量化，可以實(shí)時(shí)檢測(cè)治療效果。CYTENA的C.LIVE Tox試劑允許在AICD過程中直接檢測(cè)死細(xì)胞。除了自動(dòng)圖像分析之外，用戶還可以通過基于圖像的方法監(jiān)測(cè)細(xì)胞形態(tài)，以獲得細(xì)胞死亡過程的詳細(xì)見解。
4. 激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡
使用CELLCYTE X能夠?qū)^程進(jìn)行詳細(xì)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。觀察到的殺傷效果取決于效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例，這是由于更高數(shù)量CAR-T細(xì)胞顯示出更高的總熒光強(qiáng)度，這表明靶細(xì)胞的殺傷更有效、更早。此外，每小時(shí)掃描可以全面實(shí)時(shí)記錄這些快速免疫細(xì)胞殺傷過程。用CELLCYTE X進(jìn)行的觀察結(jié)果與將CD19導(dǎo)向的CAR - T細(xì)胞治療B細(xì)胞惡性腫瘤非常有效的研究相一致。（7）
活細(xì)胞成像技術(shù)在免疫學(xué)應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)
德國Cytena開發(fā)的CELLCYTE X 新一代活細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)成像及功能分析系統(tǒng)可內(nèi)置在任何品牌型號(hào)的CO2培養(yǎng)箱中，對(duì)正常培養(yǎng)中的細(xì)胞做長時(shí)間實(shí)時(shí)24小時(shí)循環(huán)拍攝成像，監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長變化狀態(tài)，并對(duì)其進(jìn)行功能分析，輸出隨時(shí)間變化曲線、各個(gè)時(shí)間點(diǎn)圖片、過程影像等數(shù)據(jù)結(jié)果。在免疫學(xué)應(yīng)用中，它有以下優(yōu)勢(shì)：
- 自帶強(qiáng)大的自動(dòng)聚焦算法能夠連續(xù)跟蹤不同生長形態(tài)的懸浮液中生長的各種免疫細(xì)胞。
- 使用自動(dòng)活細(xì)胞成像平臺(tái)捕捉免疫反應(yīng)的快速動(dòng)力學(xué)。
- CELLCYTE X的分析軟件提供多功能和高度特異性的讀數(shù)，記錄免疫細(xì)胞生長和健康、巨噬細(xì)胞分化和T細(xì)胞殺傷分析中的反應(yīng)。
- 通過定性形態(tài)學(xué)研究和定量測(cè)量，對(duì)不同刺激的免疫反應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)估。
參考文獻(xiàn)
1. Components of the Immune System. Primer to the Immune Response. Elsevier; 2014: 21-54. DOI:10.1016/B978-0-12-385245-8.00002-9
2. Daigneault M, Preston JA, Marriott HM, et al. The identification of markers of macrophage differentiation in PMA-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS ONE. 2010; 5(1): e8668. DOI:10.1371/journal.pone.0008668
3. 1Pinto SM, Kim H, Subbannayya Y, et al. Comparative proteomic analysis reveals varying impact on immune responses in phorbol 12-myristate-13-acetate-mediated THP-1 monocyte-to-macrophage differentiation. Frontiers in Immunology. 2021; 12. DOI:10.3389/fimmu.2021.679458
4. Widdrington JD, Gomez-Duran A, Pyle A, et al. Exposure of monocytic cells to lipopolysaccharide induces coordinated endotoxin tolerance, mitochondrial biogenesis, mitophagy, and antioxidant defenses. Frontiers in Immunology. 2018; 9. DOI:10.3389/fimmu.2018.02217
5. Tucureanu MM, Rebleanu D, Constantinescu CA, et al. Lipopolysaccharide-induced inflammation in monocytes/macrophages is blocked by liposomal delivery of Gi-protein inhibitor. International Journal of Nanomedicine. 2018; 13: 63-76. DOI:10.2147/IJN.S150918
6. Ai W, Li H, Song N, Li L, Chen H. Optimal method to stimulate cytokine production and its use in immunotoxicity assessment. International Journal of Environmental Research and Public Health. 2013; 10(9): 3834-3842. DOI:10.3390/ijerph10093834
7. Abramson JS. Anti-CD19 CAR T-cell therapy for B-cell non-hodgkin lymphoma. Transfusion Medicine Reviews. 2020; 34(1): 29-33. doi:10.1016/j.tmrv.2019.08.003
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