iPSC單克隆案例分享—MG基質(zhì)膠、CEPT提高iPSC單克隆效率

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSC）是指通過(guò)人工對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行重編程，逆分化培養(yǎng)出的一類具有類似人胚干細(xì)胞特征的多能干細(xì)胞。它們具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新的能力以及巨大的分化潛能，在藥物發(fā)現(xiàn)、合成生物學(xué)和細(xì)胞治療等方面具有巨大的前景。隨著iPSC應(yīng)用的增多，勢(shì)必有越來(lái)越多的需求去建立標(biāo)準(zhǔn)化的單克隆iPSC主細(xì)胞庫(kù)（MCB），用于后續(xù)的可持續(xù)供應(yīng)且穩(wěn)定的生產(chǎn)工藝流程中。
 

材料與方法
Cytena單細(xì)胞打印機(jī)通過(guò)專利的噴墨式打印技術(shù)，溫和的將單個(gè)細(xì)胞自動(dòng)分離到標(biāo)準(zhǔn)的96或384孔板中，分選過(guò)程中，高分辨率的光學(xué)系統(tǒng)可根據(jù)細(xì)胞直徑、圓度或熒光強(qiáng)度分選出需要的單細(xì)胞，且提供單細(xì)胞來(lái)源的圖像證據(jù)，有助于通過(guò)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的審核。

為了提高單細(xì)胞分選效率，比較不同重懸體系對(duì)分選過(guò)程的影響；為了提高克隆效率，先對(duì)不同基質(zhì)膠對(duì)克隆效率的影響進(jìn)行了比較；比較了用Y-27632或CEPT處理后的克隆效率；通過(guò)核型分析，判斷CEPT的處理是否會(huì)引起遺傳異常。

01 CEPT四組分混合物的確定
通過(guò)超低細(xì)胞密度的高通量篩選確定四因子混合物CEPT：Chroman 1 (ROCK 抑制劑), Emricasan (半胱天冬酶抑制劑)，Polyamines（多胺）和Trans-ISRIB（綜合應(yīng)激反應(yīng)抑制劑）。其用于改善細(xì)胞存活、細(xì)胞附著和蛋白質(zhì)翻譯。

02樣品準(zhǔn)備
iPSC細(xì)胞：細(xì)胞培養(yǎng)4/5天時(shí)，達(dá)到60%匯合度，使用TrypLE select消化細(xì)胞，使用 20-40 μm 過(guò)濾器（清除懸浮液中可能阻礙芯片的團(tuán)塊），最后重懸于HBSS/E8 medium/DMEM/StemFlex+ Rock抑制劑中，濃度為0.5x10⁶  cells/mL。

03單細(xì)胞分選

使用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)可直接捕獲噴嘴圖像作為嚴(yán)格單細(xì)胞分選證據(jù)。流式分選作為對(duì)照組。

04克隆增殖

選擇八個(gè)利用CEPT產(chǎn)生的克隆并建立克隆細(xì)胞系。

05核型分析

四次傳代后，對(duì)八個(gè)選擇的克隆細(xì)胞系進(jìn)行核型分析

結(jié)果
使用mTeSR/E8 + Rock抑制劑分別對(duì)樣品進(jìn)行重懸，濃度為0.5x 10⁶ cells/mL進(jìn)行上機(jī)分選都有不錯(cuò)的表現(xiàn)。在同一iPSC細(xì)胞中，對(duì)比了LN521和LN521+E-Cad的差異，發(fā)現(xiàn)E-cad的存在對(duì)單克隆率沒有提升效果，單克隆率反而降低。MG基質(zhì)膠能很顯著的提升iPSC細(xì)胞單克隆率，在LN521基質(zhì)膠中，單克隆不到1%，但是MG基質(zhì)膠中卻有38%的單克隆率。在第三個(gè)iPSC細(xì)胞中，用添加了RevitaCell的mTeSR1重懸細(xì)胞，然后分選單細(xì)胞在MG基質(zhì)膠的孔板中，獲得了68%的單克隆率。 圖1：使用不同重懸培養(yǎng)基以及不同基質(zhì)膠處理后的單克隆率表（MG: Matrigel; LN521: Laminin 521; E-Cad: E-Cadherin）

Cytena 單細(xì)胞打印機(jī)分選過(guò)程中能留下多張噴嘴圖片，在噴嘴的ROI檢測(cè)識(shí)別區(qū)域，軟件能識(shí)別細(xì)胞的直徑、圓度等參數(shù)，確認(rèn)細(xì)胞的“良好狀態(tài)”，符合要求的“強(qiáng)壯的”單細(xì)胞到孔板里，不符合要求的細(xì)胞則被真空吸走。噴嘴圖片證實(shí)單細(xì)胞來(lái)源，單細(xì)胞鋪板效率＞95%。

圖2：?jiǎn)渭?xì)胞率^[1]

Yu Chen^[2]等發(fā)現(xiàn)，相比于Y-2762,CEPT能顯著提升iPSC的單細(xì)胞過(guò)程中的存活率，相同小分子處理下，用Cytena單細(xì)胞打印機(jī)分選iPSC細(xì)胞，一塊96孔板獲得68個(gè)iPSC單克隆孔，比流式細(xì)胞儀分選高出~20%。
 

圖3：克隆恢復(fù)率	圖4：CEPT可提高單克隆率

隨機(jī)選擇八個(gè)利用CEPT產(chǎn)生的克隆建立克隆細(xì)胞系，四次傳代后，所有克隆細(xì)胞系（8/8）均為核型正常，表明CEPT不會(huì)引起遺傳異常。
 

圖5：CEPT未引起遺傳異常

圖6：Cytena 單細(xì)胞打印機(jī)用于iPSC基因修飾后的CLD

討論
iPSC對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的變化十分敏感，如pH值、滲透壓、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、機(jī)械應(yīng)力/剪切力等。在傳統(tǒng)的培養(yǎng)條件下，iPSC通常在涂有各種細(xì)胞外基質(zhì)表面上密集生長(zhǎng)。在對(duì)iPSC基因組編輯過(guò)程中，最大的挑戰(zhàn)之一是獲得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞。單個(gè)iPSC的生長(zhǎng)過(guò)程中，減少了細(xì)胞和細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的接觸，容易誘發(fā)細(xì)胞失巢凋亡，導(dǎo)致單細(xì)胞存活率顯著下降。一方面，抑制細(xì)胞失巢凋亡的產(chǎn)生，會(huì)改善單細(xì)胞存活率；另一方面，溫和的自動(dòng)化分選系統(tǒng)可以進(jìn)一步優(yōu)化陽(yáng)性單克隆細(xì)胞的篩選平臺(tái)。

在此研究中，使用Cytena 單細(xì)胞打印機(jī)展示了一個(gè)具有代表性的高效分選iPSC的工作流程。分選過(guò)程中通過(guò)捕捉噴嘴圖片證實(shí)單細(xì)胞來(lái)源，單細(xì)胞鋪板效率＞95%（圖2）；一塊96孔板獲得68個(gè)單克隆孔（圖3）；使用mTeSR/E8進(jìn)行重懸，在基質(zhì)膠的選擇中，使用MG可以顯著提高iPSC單細(xì)胞恢復(fù)率；四組分CEPT處理后的iPSC克隆有效率更高（圖4），且不會(huì)引起遺傳異常。

Cytena單細(xì)胞打印機(jī)的高效的微流控細(xì)胞分選，搭配小分子混合物CEPT的工作流程，一方面提升了iPSC的單克隆效率，同時(shí)單克隆又保持了原有的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，這一工作流程將突破現(xiàn)有的技術(shù)瓶頸成為新的標(biāo)準(zhǔn)流程，能滿足后續(xù)的單克隆iPSC主細(xì)胞庫(kù)（MCB）的建立需求，用于日后的可持續(xù)供應(yīng)和穩(wěn)定的生產(chǎn)流程。

參考文獻(xiàn):
1.Vallone et al. Methods for Automated Single Cell Isolation and Sub-Cloning of Human Pluripotent Stem Cells, Current Protocols in Stem Cell Biology e123, Volume 55(2020).
2.Chen Y , Carlos A. T ,  Chen L,et al. A Versatile Polypharmacology Platform Promotes Cytoprotection and Viability of Human Pluripotent and Differentiated Cells. Nat Methods. 18(5), 528–541(2021).