技術比拼之M20技術下的FFPE樣本單細胞RNA測序原理及技術特點

書接上回，上周跟大家分享了基于Flex技術的FFPE樣本單細胞RNA測序解決方案，其中提到了M20技術也可以對FFPE樣本進行單細胞測序。那M20技術有什么特點呢？M20技術和Flex技術比較又各有什么特點呢？下面我們一一道來。首先我們會介紹M20技術原理，技術特點，實測數(shù)據(jù)質量表現(xiàn)，以及M20文章案例，然后對兩種技術進行比較與總結，希望能夠幫助大家更好的選擇適合自己研究的技術平臺。
 

M20技術原理及工作流程

M20技術基于隨機引物擴增原理，可實現(xiàn)全樣本類型、全物種、全長RNA的高通量單細胞轉錄組測序。首先將樣本制備成單細胞或單細胞核懸液，對FFPE樣本就是分離單細胞核之后進行核膜的透化，使得隨機引物以及試劑進入細胞核內，然后隨機引物在細胞核內進行原位逆轉錄以捕獲全轉錄組的全長信息，并在cDNA一鏈末端加上捕獲接頭。最后單個細胞核中的cDNA在微液滴平臺或者微孔平臺上完成細胞標記，隨后進行擴增和二代測序。
 

圖 M20 seq技術路線

M20 seq技術優(yōu)勢

▪ 全樣本類型：不僅可用于新鮮組織、凍存組織，還可以完美解決FFPE樣本難以進行單細胞轉錄組測序的難題。
▪ 全長序列轉錄組測序：單細胞全長RNA測序可實現(xiàn)對基因突變、基因融合、拷貝數(shù)變異、可變剪接等基因結構的研究。
▪ 全轉錄組測序：不同于10x的3’RNA捕獲和探針捕獲原理，基于隨機引物的M20技術同時可檢測到mRNA和非編碼RNA（主要是lncRNA）。實現(xiàn)了單細胞水平對lncRNA進行研究的技術突破。
▪ 跨平臺兼容性：在微液滴（如10x）與微孔技術（如BD）平臺均能獲得優(yōu)異的檢測效果。
▪ 全物種：無論是細菌等原核生物細胞，還是人類、動物、植物等真核生物細胞，都可以通過M20 Seq進行測序。
▪ 超高通量：細胞捕獲數(shù)大幅提高，最高可達到百萬級，是現(xiàn)有單細胞測序技術通量的百倍以上。
 

圖M20 seq技術優(yōu)勢
 

M20技術對FFPE樣本進行實測數(shù)據(jù)展示

下面為大家展示基于M20技術對FFPE樣本單細胞測序的數(shù)據(jù)質量。首先看一下M20 Genomics官方公布的多種人的FFPE組織樣本（如肺癌、肝癌、乳腺癌等）的測試數(shù)據(jù)，從數(shù)據(jù)結果來看，測序數(shù)據(jù)量在100G左右的時候可檢測到的細胞數(shù)均能達到5000+，單個細胞中位基因數(shù)在800-1400之間�？粗�這樣的FFPE樣本測序數(shù)據(jù)結果還是很可喜的！
 

嚴謹如我，伯豪同樣用FFPE樣本對M20技術進行了多次測試評估。這里我們對一例前列腺癌樣本同時進行了M20和Flex兩種技術檢測的數(shù)據(jù)結果進行展示，在同一樣本相同數(shù)據(jù)量的情況下縱向比較兩種技術對FFPE樣本進行單細胞測序的數(shù)據(jù)情況。

（1）FFPE樣本單細胞測序基本信息統(tǒng)計

測序基本信息統(tǒng)計中我們重點來看細胞數(shù)、中位基因數(shù)和檢測到的總基因數(shù)這三個重要指標。在相同數(shù)據(jù)量的情況下，實測細胞數(shù)是M20 seq檢測到的更多（11067>9865），每個細胞的中位基因數(shù)檢出是10x Flex略顯優(yōu)勢（1243>1002），在基因總數(shù)檢出方面是M20 seq具有獨特優(yōu)勢（35757>16427）。

（2）FFPE樣本細胞群鑒定結果
在細胞群聚類和注釋這一步，通過singleR自動注釋，M20的數(shù)據(jù)僅使用mRNA的高可變基因進行細胞注釋的結果與Flex數(shù)據(jù)結果一致，鑒定出相同的細胞類群。
 

圖 僅用mRNA數(shù)據(jù)的M20 seq與10x Flex的SingleR注釋結果
 

這里需要強調的是基于隨機引物擴增原理的M20 seq不僅能夠檢測到mRNA，還能檢測到非編碼RNA（包括lncRNA，miRNA等，主要檢測到的是lncRNA）,而基于探針捕獲原理的Flex技術目前只能檢測mRNA的表達信息。我們進一步利用M20 seq中的mRNA以及lncRNA數(shù)據(jù)共同進行降維聚類，SingleR注釋結果發(fā)現(xiàn)比10x Flex增加了中性粒細胞、平滑肌細胞群。

看到這個結果不知大家是否有疑問：同一樣本，為什么增加了lncRNA信息之后細胞群注釋“憑空”多出了兩種細胞類群呢？嚴謹如我，小編用經(jīng)典marker基因進行人工注釋確實驗證了這個樣本是有中性粒細胞和平滑肌細胞存在的。這證明了增加lncRNA可提升細胞聚類注釋效果，提高單細胞數(shù)據(jù)的細胞群鑒定分辨率，有可能發(fā)現(xiàn)新的細胞亞群。
 

圖 M20 Seq基于mRNA以及非編碼RNA進行降維聚類、SingleR注釋

（3）lncRNA占比分析結果統(tǒng)計
以往的單細胞轉錄組能夠檢測到的lncRNA很少，因此目前單細胞水平的lncRNA研究有較大空白。從上述的細胞注釋結果能夠看出增加lncRNA的單細胞數(shù)據(jù)可能提供更多的生物學信息。那M20 技術能夠檢測到多少lncRNA呢？從M20 Seq檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果可以看到，每個細胞檢測到的lncRNA占比在6%-30%。從這個結果小編看到了單細胞中具有重要生物學意義的lncRNA在向我們招手！
 

M20技術對FFPE樣本進行單細胞核測序的文章案例

下面跟大家分享一篇M20 Genomics團隊近期在NC期刊發(fā)表的M20 Seq技術對FFPE樣本進行單細胞核測序的文章。
 

文章標題：High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq
發(fā)表期刊：Nature Communications
發(fā)表時間：2023年5月
文章摘要：該研究介紹了通過隨機引物捕獲全長總RNA，用于FFPE組織的單細胞核測序新技術——SnRandom-seq（也就是M20 seq）。文章首先展示了SnRandom-seq對FFPE小鼠組織和FFPE人肝癌樣本進行單細胞核測序（SnRNA-seq）的結果，說明SnRandom-seq技術可為臨床FFPE樣本提供一個強大的SnRNA-seq平臺。然后從相同的小鼠組織中收集FFPE和新鮮樣本，通過SnRandom-seq發(fā)現(xiàn)它們的RNA表達具有很高的相關性。最后文章還對SnRandom-seq與其他兩種FFPE snRNA-seq方法進行了比較，重點強調了SnRandom-seq對lncRNA的檢出優(yōu)勢，以及snRandom-seq可以捕獲FFPE組織中更多的RNA，且基因覆蓋度更高。
 

圖 snRandon-seq與其他兩種FFPE snRNA-seq方法的比較

小編以為，文章中還有一個亮點值得拎取出來展示。那就是snRandom-seq在FFPE樣本中可以同時檢測到外顯子和內含子序列，可以用于區(qū)分新轉錄的RNA（未剪接）和成熟的RNA（未剪接），因此更適合于RNA速率分析。再結合細胞周期分析，就能更好地探究細胞分化軌跡。
 

圖 基于snRandom-seq數(shù)據(jù)分析FFPE小鼠睪丸組織的細胞分化軌跡及細胞周期狀態(tài)

首先，F(xiàn)FPE樣本的實測數(shù)據(jù)和兩種技術的案例文章足以證明M20技術和Flex技術都實現(xiàn)了對FFPE樣本進行單細胞測序的技術突破。那問題就來了：哪種技術更好？應該怎么選呢？下面小編就來進行兩種技術特點的總結與比較，希望能夠解決大家的困擾。

基于技術原理的不同，M20技術（隨機引物進行原理逆轉錄原理）和Flex技術（探針雜交捕獲原理）進行FFPE樣本單細胞測序各有特色：
（1）在樣本類型方面：兩種技術都能夠對FFPE樣本，凍存樣本，新鮮組織樣本等多種類型的樣本進行檢測。這里再次強調對FFPE樣本單細胞測序技能的解鎖，簡直就是打開了臨床病理樣本資源庫，應用前景不可限量。
（2）在物種適用方面：Flex技術目前僅適用于人和小鼠，M20技術沒有物種限制，人、動植物及微生物均適用。就FFPE樣本而言，適用于人和小鼠兩個物種其實基本已經(jīng)滿足大家研究需要了。
（3）在測序數(shù)據(jù)方面：就目前我們實測的FFPE樣本數(shù)據(jù)來看，F(xiàn)lex技術檢測到的中位基因數(shù)略占優(yōu)勢，而在檢測到的基因總數(shù)上M20技術是占絕對優(yōu)勢的（Flex檢測基因總數(shù)最高18000，M20 檢出的基因總數(shù)可達30000-40000）。
（4）在數(shù)據(jù)挖掘方面：Flex技術只能檢測到FFPE樣本中的mRNA表達信息，而M20技術能夠同時檢測到mRNA和非編碼RNA表達特征。所以M20技術在單細胞水平挖掘有重要生物學含義的非編碼RNA這一研究方向具有獨特優(yōu)勢。

相較于一決高下，我們更期待看到的是百花齊放，百家爭鳴的局面。所幸事實如此，M20和Flex技術總結比較下來，確實很難評出優(yōu)劣。據(jù)此，伯豪生物同時引進M20和Flex兩種技術，希望能夠為大家提供更廣泛的科研服務。那想要對FFPE樣本進行單細胞測序，這兩種技術該如何選擇呢？在此給出一些具體建議供大家參考：

（1）看重測序數(shù)據(jù)中的中位基因數(shù)這一指標，從當前樣本來看，10x Flex檢測出的中位基因數(shù)更具優(yōu)勢。一方面在原理上是因為基因特異性探針的靈敏度和特異性更高，更加容易覆蓋中低豐度基因；另一方面M20在當前數(shù)據(jù)量下的細胞數(shù)略多，加大測序深度可能會增加中位基因數(shù)。我們可以期待后面更多的實測數(shù)據(jù)對比；
（2）看重測序數(shù)據(jù)中檢測到的基因總數(shù)，或者想挖掘新基因，建議選擇M20 seq；
（3）想要同時對FFPE樣本進行單細胞RNA測序和空間轉錄組測序，建議選擇10x Flex單細胞RNA測序和Visium FFPE空間轉錄組測序。兩種技術用到是同一套探針，所以兩種數(shù)據(jù)的聯(lián)合分析相關性會更高；
（4）想要在單細胞水平關注非編碼RNA，特別是lncRNA的表達信息，挖掘FFPE樣本中重要的lncRNA生物標志物，建議選擇M20 seq；
（5）更個性化的想法與需求就需要我們共同溝通探討選擇更優(yōu)方案。