細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因功能常見(jiàn)思路解析

當(dāng)通過(guò)組學(xué)、文獻(xiàn)、芯片等數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)某個(gè)基因可能在某個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮功能時(shí)，那么下一步該如何驗(yàn)證呢？這是大部分的科研僧都會(huì)遇到的問(wèn)題，其中具體的方式有很多種，一般都需要根據(jù)實(shí)際情況分析，但是常規(guī)基礎(chǔ)思路可以給大家分享一下，大部分的驗(yàn)證功能都是可以通過(guò)此方案進(jìn)行，若本基因有一些特殊作用可以相對(duì)應(yīng)添加特殊實(shí)驗(yàn)，比如油紅O染色、鬼筆環(huán)肽染色、活死染色等。
 
一、實(shí)驗(yàn)材料： 疾病對(duì)應(yīng)的細(xì)胞系（或者是原代細(xì)胞），預(yù)算充足情況下可以選擇2種細(xì)胞系，暫定為：A和B細(xì)胞
二、實(shí)驗(yàn)方案：敲低兩種細(xì)胞的目的基因1、過(guò)表達(dá)兩種細(xì)胞的目的基因1（若是miRNA可以使用mimics、inhibitor）
三、干擾片段篩選：2種細(xì)胞都需要篩選（當(dāng)用mimics和inhibitor時(shí)也需要初步篩選表達(dá)效果）
目的基因1干擾片段篩選：針對(duì)目的基因1設(shè)計(jì)并合成3條siRNA及NC，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，QPCR篩選出干擾效果最好的片段進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)； 
四、實(shí)驗(yàn)分組：A或B細(xì)胞

• A
• A+siRNA NC對(duì)照組
• A+siRNA目的基因1干擾
• A+過(guò)表達(dá)目標(biāo)基因1 
• A+過(guò)表達(dá)空載
• 抑制劑處理濃度1

五、檢測(cè)項(xiàng)目：

• 細(xì)胞增殖或者細(xì)胞毒性檢測(cè)（CCK法/MMT），
• 流式檢測(cè)細(xì)胞周期，
• 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡，
• 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（transwell），遷移、劃痕
• WB檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)變化，
• QPCR檢測(cè)信號(hào)通路中基因的表達(dá)， 
• 免疫熒光檢測(cè)下游信號(hào)通路蛋白
• 流式多色檢測(cè)某些marker指標(biāo)
• Coip檢測(cè)A和B蛋白是否結(jié)合
• 雙熒光素酶檢測(cè)A和B是否結(jié)合
• 油紅O染色
• 生化檢測(cè)：SOD，CAT等
• 透射電鏡

 
 
六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果（上述檢測(cè)類似結(jié)果，非本實(shí)驗(yàn)的實(shí)際結(jié)果）
1. 細(xì)胞增殖（CCK8）/MMT
此實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK8的方法證明了A、B、C細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的抑制作用。
2. 流式檢測(cè)細(xì)胞周期
流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，判斷不同藥物處理下的細(xì)胞的DNA復(fù)制情況，細(xì)胞周期是否受影響。
3、 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理下細(xì)胞的凋亡狀況，確實(shí)藥物或者某基因是否調(diào)控了細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。
4、 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（transwell），遷移、劃痕

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，測(cè)試細(xì)胞在不同處理下的細(xì)胞本身能力，判斷藥物或者某個(gè)基因的影響。
5、 WB檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路中蛋白的表達(dá)變化

通過(guò)western blot方法檢測(cè)不同藥物處理下目標(biāo)蛋白的表達(dá)量變化情況，判斷哪些信號(hào)通路參與了上述藥物處理過(guò)程，是研究分子機(jī)制的關(guān)鍵檢測(cè)方法。
6、 QPCR檢測(cè)信號(hào)通路中基因的表達(dá)


通過(guò)QPCR的檢測(cè)，判斷不同處理下細(xì)胞內(nèi)某些基因的RNA表達(dá)水平，判斷這些基因是否參與了上述分子機(jī)制。
7、 免疫熒光檢測(cè)下游信號(hào)通路蛋白

通過(guò)免疫熒光的方式，可以判斷在不同細(xì)胞處理下目標(biāo)蛋白A和B的表達(dá)強(qiáng)弱，定位以及是否共定位等目的。
8、 油紅O染色

通過(guò)油紅O染色判斷不同處理下細(xì)胞內(nèi)脂肪情況，判斷不同處理不對(duì)脂肪生產(chǎn)情況的影響。
 
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