DAP-seq技術(shù)在豬苓菌絲生長及滲透脅迫耐受研究中的應(yīng)用

豬苓（Polyporus umbellatus）是一種可食用的蘑菇，也是我國常用的菌類藥材之一，至今已有2000多年的藥用歷史，在《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《本草求真》等典籍中均有記載。豬苓具有利尿、抗菌作用，近年來研究還發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用。當(dāng)前醫(yī)藥衛(wèi)生業(yè)對豬苓的需求量逐年增加。但是，豬苓的野生資源越來越少，而且種植周期較長，單產(chǎn)較低。豬苓具有產(chǎn)生菌核的能力，然而，其菌核形成的分子機制尚不清楚。因此，研究豬苓的生長發(fā)育及其調(diào)控機制，發(fā)展優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的豬苓種系和栽培技術(shù)，將有助于緩解豬苓供應(yīng)緊張的問題。

2023年4月6日，中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心黃璐琦院士/袁媛研究員課題組的研究成果，發(fā)表在Frontiers in Microbiology期刊上(影響因子6.064)，文章題目為“PuCRZ1, an C2H2 transcription factor from Polyporus umbellatus, positively regulates mycelium response to osmotic stress”。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術(shù)鑒定了豬苓中一個C2H2轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序及其靶基因，揭示了PuCRZ1參與調(diào)控豬苓菌絲生長以及滲透脅迫耐受的分子機制。

CRZ1（鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶反應(yīng)性鋅指轉(zhuǎn)錄因子）是C2H2家族轉(zhuǎn)錄因子，參與Ca²⁺-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路，具有調(diào)節(jié)菌核形成、維持離子穩(wěn)態(tài)和應(yīng)對脅迫等功能。CRZ1同源物都具有一個或多個特征性C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，且它們的功能和調(diào)控基因在不同物種之間存在差異。目前，對于擔(dān)子菌CRZ1基因的研究還很少，僅在靈芝中進行過研究。

該研究首先鑒定了豬苓基因組中包含28個C2H2轉(zhuǎn)錄因子。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，其中13個基因的轉(zhuǎn)錄水平在菌絲體和菌核之間存在差異，包括PuCRZ1。PuCRZ1基因全長801 bp，編碼了一個包含266個氨基酸的蛋白質(zhì)，是一個核定位蛋白。

圖1. 通過DAP-seq鑒定PuCRZ1在全基因組的靶基因。

通過DAP-seq分析，鑒定到了PuCRZ1的保守結(jié)合基序為GTGGCG。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，peak相關(guān)基因在抗生素生物合成、次級代謝產(chǎn)物生物合成、類固醇生物合成、自噬和內(nèi)吞作用等信號通路中顯著富集，并從KEGG通路顯著富集的基因中發(fā)現(xiàn)了12個可能與豬苓菌核形成相關(guān)的基因。于是，進一步采用qRT-PCR鑒定到3個在菌絲體和菌核之間存在顯著差異表達的靶基因PuG10、PuG11、PuG12。酵母單雜交（Y1H）和凝膠阻滯實驗（EMSA）進一步驗證了PuCRZ1可以結(jié)合到PuG10、PuG11和PuG12的啟動子區(qū)域。

圖2. 在不同處理條件下，轉(zhuǎn)基因豬苓菌株的菌落形態(tài)和生長速率。

在酵母中過表達PuCRZ1基因后，降低了酵母細胞對NaCl和CaCl₂的敏感性。之后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，在豬苓中分別構(gòu)建了過表達PuCRZ1、PuG10、PuG11和PuG12的轉(zhuǎn)基因菌株。然后，分別接種到20 mM NaCl、5 mM CaCl_2、150 mM甘露醇培養(yǎng)基上。生長30天后，觀察發(fā)現(xiàn)PuCRZ1過表達菌株在NaCl和CaCl₂培養(yǎng)基中的菌落直徑小于野生型菌株（WT），表明PuCRZ1過表達菌株對Na⁺和Ca²⁺更敏感。PuG10、PuG11、PuG12過表達菌株在NaCl和CaCl₂培養(yǎng)基中的菌落直徑無明顯差別，卻在對照培養(yǎng)基和甘露醇培養(yǎng)基上均明顯大于WT菌株，其中PuG11過表達菌株的菌落直徑最大。這表明PuCRZ1調(diào)控的三個靶基因PuG10、PuG11、PuG12均可以提高菌絲體生長速度和對甘露醇脅迫的耐受性。以上結(jié)果表明PuCRZ1基因不直接調(diào)節(jié)對離子和滲透脅迫的耐受性，而是通過其靶基因?qū)γ{迫作出反應(yīng)。

此外，還發(fā)現(xiàn)PuG11基因編碼的蛋白含有FYVE結(jié)構(gòu)域，這是一種鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，該研究擴展了對真菌中含有FYVE結(jié)構(gòu)域蛋白的功能和機制的理解。

圖3. CRZ1及其靶基因在Ca2+-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路中的調(diào)控機制圖。

總結(jié)：該研究首次將DAP-seq技術(shù)應(yīng)用于藥用真菌的研究，為基因及分子間相互作用研究提供了新的技術(shù)借鑒。該研究揭示了PuCRZ1-鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路在豬苓菌絲體生長以及滲透脅迫耐受中起重要作用，填補了國際上對豬苓CRZ1以及含F(xiàn)YVE結(jié)構(gòu)域蛋白功能研究的空白，也為深入開展豬苓菌核形成機制的研究提供了理論依據(jù)。

論文鏈接：https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1131605

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