細胞實驗驗證基因功能常見思路解析

當通過組學(xué)、文獻、芯片等數(shù)據(jù)預(yù)測某個基因可能在某個生物學(xué)過程中發(fā)揮功能時，那么下一步該如何驗證呢？這是大部分的科研僧都會遇到的問題，其中具體的方式有很多種，一般都需要根據(jù)實際情況分析，但是常規(guī)基礎(chǔ)思路可以給大家分享一下，大部分的驗證功能都是可以通過此方案進行，若本基因有一些特殊作用可以相對應(yīng)添加特殊實驗，比如油紅O染色、鬼筆環(huán)肽染色、活死染色等。
 
一、實驗材料： 疾病對應(yīng)的細胞系（或者是原代細胞），預(yù)算充足情況下可以選擇2種細胞系，暫定為：A和B細胞
二、實驗方案：敲低兩種細胞的目的基因1、過表達兩種細胞的目的基因1（若是miRNA可以使用mimics、inhibitor）
三、干擾片段篩選：2種細胞都需要篩選（當用mimics和inhibitor時也需要初步篩選表達效果）
目的基因1干擾片段篩選：針對目的基因1設(shè)計并合成3條siRNA及NC，轉(zhuǎn)染細胞，QPCR篩選出干擾效果最好的片段進行后續(xù)實驗； 
四、實驗分組：A或B細胞

• A
• A+siRNA NC對照組
• A+siRNA目的基因1干擾
• A+過表達目標基因1 
• A+過表達空載
• 抑制劑處理濃度1

五、檢測項目：

• 細胞增殖或者細胞毒性檢測（CCK法/MMT），
• 流式檢測細胞周期，
• 流式檢測細胞凋亡，
• 細胞侵襲實驗（transwell），遷移、劃痕
• WB檢測細胞信號通路中蛋白的表達變化，
• QPCR檢測信號通路中基因的表達， 
• 免疫熒光檢測下游信號通路蛋白
• 流式多色檢測某些marker指標
• Coip檢測A和B蛋白是否結(jié)合
• 雙熒光素酶檢測A和B是否結(jié)合
• 油紅O染色
• 生化檢測：SOD，CAT等
• 透射電鏡

 
六、實驗結(jié)果（上述檢測類似結(jié)果，非本實驗的實際結(jié)果）

• 細胞增殖（CCK8）/MMT

 

• 流式檢測細胞周期

 

• 流式檢測細胞凋亡

 

• 細胞侵襲實驗（transwell），遷移、劃痕

• WB檢測細胞信號通路中蛋白的表達變化

• QPCR檢測信號通路中基因的表達

• 免疫熒光檢測下游信號通路蛋白

 

• 油紅O染色