爪蟾卵母細(xì)胞中電壓鉗技術(shù)檢測通道蛋白和受體蛋白

     
電壓鉗（voltageclamp）又叫電壓鉗制或電壓固定，該技術(shù)由Cole和Marment設(shè)計，后經(jīng)Hodgkin和Huxley改進并成功地應(yīng)用于神經(jīng)纖維動作電位的研究。
     
其設(shè)計原理是根據(jù)離子作跨膜移動時形成了跨膜離子電流（I），而通透性即離子通過膜的難易程度，其膜電阻（R）的倒數(shù)，也就是膜電導(dǎo)（G）。因此，膜對某種離子通透性增大時，實際上時膜電阻變小，即膜對該離子的電導(dǎo)加大。根據(jù)歐姆定律V=IR，即I=V/R=VG，所以，只要固定膜兩側(cè)電位差（V）時，測出的跨膜電流（I）的變化，就可作為膜電導(dǎo)變化的度量，即可了解膜通透性的改變情況。
     
目前電壓鉗技術(shù)在爪蟾卵母細(xì)胞中應(yīng)該得非常成熟，成為研究各種離子通道蛋白或者轉(zhuǎn)運體蛋白的重要技術(shù)，其中水通道蛋白、K離子通道蛋白、Na離子通道蛋白、糖轉(zhuǎn)運蛋白、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白以及一些氣味受體均可用此技術(shù)進行機制研究。
 
卵母細(xì)胞表達體系優(yōu)點：
（1）異源表達其他物種通道蛋白，不受其他物種另外蛋白以及電源的影響，利于單獨研究此蛋白功能；
（2）爪蟾卵母細(xì)胞量多且獲得率高，爪蟾也不需處死，可以反復(fù)使用；
（3）卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)方法簡單，且可以異源表達其他各類物種的基因；
（4）表達簡單，不用像其他動物、植物物種需要進行載體轉(zhuǎn)化，直接注射RNA進入卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中即可表達；
（5）卵母細(xì)胞體積大，本身離子通道較少，對研究影響較��；
 
下列給大家介紹我們做過的2種電壓鉗實驗：離子通道研究以及受體研究。
 
1.載體構(gòu)建
注入爪蟾卵母細(xì)胞中的是目標(biāo)基因的RNA，因此需要我們在體外合成RNA。我們需要構(gòu)建載體，進行體外cRNA合成實驗，載體有多種，常見的有pGEMHE等，此類載體通常會融合表達GFP、mCherry等熒光蛋白，用于后續(xù)實驗中。
 
2.體外轉(zhuǎn)錄cRNA

1. 大提擴繁的A-pGEMHE-mCherry質(zhì)粒先進行酶切線性化；
2. 線性化后的質(zhì)粒純化后，使用T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（mMESSAGE，Invitrogen），轉(zhuǎn)錄獲取cRNA；
3. 利用試劑盒配套的DNaseI 消化DNA模板，并用LiCl法純化cRNA，除鹽；

3.顯微注射cRNA
（1）獲取非洲爪蟾的卵細(xì)胞，利用30 mg/ml collagenase D (Roche) 酶解（22℃，1-1.5h）去除卵細(xì)胞表面的囊膜；
（2）挑選IV-VI期，即成熟卵細(xì)胞，使用顯微注射系統(tǒng)，注入cRNA：
Control：30nl H₂O (Nuclease-free) / cell       A: 30nl / cell
（3）注射后卵細(xì)胞在Ringer 溶液中孵育36h，16℃，及時剔除死卵，更換新鮮溶液
 
4.熒光表達檢測
利用熒光共聚焦顯微鏡（Leica SP8 Laser confocal microscope (Leica, GER)）檢測蛋白表達情況。GFP熒光使用512 nm激光激發(fā)，mCherry 熒光使用546 nm激光激發(fā)。
 
5.電壓鉗檢測Kinase激酶影響離子通道，數(shù)據(jù)統(tǒng)計

1. Control
2. KT組
3. KT+Kinase組

結(jié)論：Kinase蛋白通過和KT的作用進而抑制離子通道。
 
6.電壓鉗檢測各種溶液對A受體蛋白的影響，數(shù)據(jù)統(tǒng)計
（1）空白組
（2）A組
針對上述2組卵母細(xì)胞進行溶液的灌流，統(tǒng)計電流。[1]  
結(jié)論：Z9-14:Ald溶液明顯有電流產(chǎn)生，表示A蛋白可能是Z9-14:Ald溶液的受體蛋白。

參考文獻：
Wang G , GM Vásquez, Schal C , et al. Functional characterization of pheromone receptors in the tobacco budworm Heliothis virescens[J]. Insect Molecular Biology, 2011, 20(1):125-133. 
 
電壓鉗技術(shù)還可以檢測更多其他蛋白和蛋白之間的作用，我們也做了很多種類，此處就不再一一列舉，希望大家有所了解后，可以在研究中充分利用此技術(shù)，結(jié)合其他蛋白互作、蛋白磷酸化等技術(shù)，更加充分的闡述相關(guān)作用機制。