拉伸導(dǎo)致細胞應(yīng)激和原代羊膜細胞中Nrf2下調(diào)的機制

早產(chǎn)現(xiàn)象是造成新生兒發(fā)病與死亡的主要原因，早產(chǎn)占所有分娩數(shù)的5%-15%。在正常妊娠期間，胎膜（由外層的平滑絨毛膜和內(nèi)層的羊膜組成）必須保持完整性，直至分娩。雖然胎膜常在分娩時破裂，但在此之前，生物化學和生物物理變化被認為會減弱胎膜。膜破裂前可見的生化變化包括炎癥和氧化應(yīng)激，它們在膜弱化中起到很大的作用。子宮內(nèi)氧化應(yīng)激累積會加速炎癥的積累，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)成分降解，從而導(dǎo)致胎膜變?nèi)酢Ｗ鳛檠趸瘧?yīng)激和炎癥的誘導(dǎo)劑，拉伸力在胎膜弱化過程中也很重要。

盡管與分娩相關(guān)的研究較少，但轉(zhuǎn)錄因子NFE2相關(guān)因子2（Nrf2）是一種參與調(diào)節(jié)DNA轉(zhuǎn)錄、細胞存活和炎癥調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。Nrf2已成為抗氧化反應(yīng)中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并與氧化應(yīng)激相關(guān)的毒性和慢性疾病有關(guān)。雖然已知Nrf2可由ROS和細胞應(yīng)激激活，但過度的應(yīng)激條件（如膿毒性休克和高水平的氧化應(yīng)激）會矛盾地損害Nrf2的表達，導(dǎo)致炎癥和組織損傷增加。已證明Nrf2缺乏與核因子-kB（NF-kB）介導(dǎo)的炎癥有關(guān)。然而，Nrf2也隨分娩而降低，其活化會降低細胞因子IL-6的表達。但是目前，拉伸對Nrf2活性的影響尚未在胎膜的羊膜細胞中專門探索。由于高水平的氧化應(yīng)激和增加的炎癥與胎膜的減弱有關(guān)，因此Nrf2的作用，特別是其下調(diào)，與此有關(guān)。

基于此，在美國夏威夷大學馬諾阿分校醫(yī)學院解剖學、生物化學與生理學系，韋恩州立大學醫(yī)學院等團隊的一項研究中，旨在確定體外拉伸對羊膜上皮細胞應(yīng)激和Nrf2的影響。實驗假設(shè)體外拉伸會誘導(dǎo)細胞應(yīng)激反應(yīng)，激活促炎介質(zhì)；ROS，HMGB1和NF-kB，同時下調(diào)Nrf2。 由于其在細胞保護中的作用，闡明體外拉伸對Nrf2的影響可以深入了解其在胎膜中的作用。




拉伸誘導(dǎo)細胞應(yīng)激反應(yīng)

前期已經(jīng)證明對人羊膜上皮細胞（hAECs）的拉伸可以增加促炎細胞因子的產(chǎn)生，因此實驗進一步表征了由這種刺激誘導(dǎo)的hAECs的細胞反應(yīng)。體外拉伸裝置設(shè)置為20% 的循環(huán)拉伸和釋放實驗持續(xù)4、8和16小時，間隔27秒拉伸幅度為20%，然后將拉伸釋放7秒至0%。乳酸脫氫酶（LDH）活性的速率是細胞應(yīng)激的非特異性標志物。結(jié)果表明，拉伸4 h顯著提高了LDH活性（圖1 A）。由于LDH數(shù)據(jù)提供了拉伸引起細胞應(yīng)激的證據(jù)，因此研究了拉伸對危險相關(guān)分子模式分子HMGB1的直接影響。在hAEC拉伸4 h 的條件培養(yǎng)基中，HMGB1分泌量顯著增加（圖1 B）。由于hAECs顯示細胞在拉伸后變得應(yīng)激，因此通過用免疫熒光測量NF-kB p65亞基易位到細胞核來測量其對促炎NF-kB級聯(lián)反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hAEC拉伸4 h 顯著增加了NF-kB p65亞基核易位（圖1 C）。
（A）動力學測量的LDH活性（mU/μL）隨著拉伸而增加。（B）ELISA定量拉伸4小時和未拉伸hAECs的細胞培養(yǎng)上清液HMGB1（ng/μL）的含量。（C）hAECs中p65蛋白核定位的免疫熒光分析。（i,ii）對照原代羊膜上皮細胞的DAPI-藍（1μg/ mL）和p65（1/500）染色。（iv,v）分別對拉伸的原代羊膜上皮細胞進行DAPI和p65染色。（iii,vi）分別合并了對照細胞和拉伸細胞的 DAPI 和 p65 信號。


Nrf2在人胎膜細胞中表達，并在hAEC分離和細胞培養(yǎng)后保持表達

Nrf2水平已被證明隨著分娩在胎膜中降低。因此，實驗使用模型系統(tǒng)研究拉伸對Nrf2表達的影響，試圖確定在人類胎膜收集期的基礎(chǔ)表達水平是否足夠高，以便研究其調(diào)節(jié)機制。對收集的胎膜組織的定性免疫組織化學分析顯示， 與 IgG（對照）染色相比，Nrf2在羊膜、絨毛膜和蛻膜細胞中表達強烈（圖2 A）。在羊膜中，羊膜間充質(zhì)細胞（hAECs）的Nrf2表達信號相對強于對照組（圖2 C、D）。然而，hAEC和hAMC Nrf2信號都具有強大的核表達。然后，在收集的羊膜細胞中確認了Nrf2在基因水平上的表達，并將其與HeLa污染的羊膜上皮樣細胞（WISH），胎盤組織和hAMCs中的Nrf2表達進行了比較（圖2 E）。此外還測量了hAMCs的表達，因為免疫組織化學發(fā)現(xiàn)這些細胞具有強表達（圖2 A）。hAECs和hAMCs的基因表達水平均低于WISH細胞系，但高于分離的胎盤組織。hAECs的Nrf2表達高于hAMCs。異硫氰酸熒光素（FITC）標記的Nrf2的免疫細胞化學分析進一步證實了細胞分離后 Nrf2 在 hAECs 中的表達（圖2 F-H）。
（A）Nrf2在胎膜中的代表性免疫組織化學圖像，放大倍數(shù)20×Nrf2（B）IgG對照。（C）羊膜層Nrf2和（D）IgG染色組織羊膜層IgG染色組織。（E）歸一化為GAPDH的Nrf3表達的qPCR分析。（F-H）hAECs中 Nrf2 表達的免疫細胞化學，分別放大 60x FITC標記的 Nrf2、DAPI 染色和合并圖像。


體外拉伸下調(diào)人羊膜上皮細胞Nrf2的表達

已經(jīng)確認Nrf2在hAECs 組織和細胞水平上的穩(wěn)健基線表達（圖2 D），因此實驗使用這種羊膜細胞類型來確定機械拉伸對該轉(zhuǎn)錄因子的影響。hAEC最初進行 20% 的循環(huán)拉伸持續(xù)4、8和16小時。拉伸4 h后，與未拉伸細胞的對照相比，細胞內(nèi) Nrf2的水平顯著降低（圖3 A）。拉伸8和16 h后，Nrf2表達降低，但Nrf2蛋白表達無顯著差異，因為在未拉伸對照條件下，Nrf2表達也降低。由于20%循環(huán)拉伸持續(xù)4 h導(dǎo)致Nrf2表達與對照條件相比顯著降低，因此研究了Nrf2易位到細胞核的影響，結(jié)果表明，機械拉伸使細胞核Nrf2表達顯著降低（圖3 B）。這些結(jié)果證實了機械拉伸導(dǎo)致Nrf2水平的降低。由于Nrf2在拉伸后被下調(diào)，而ROS的產(chǎn)生可以下調(diào)Nrf2活性，因此在拉伸后測量了ROS的產(chǎn)生，結(jié)果表明，拉伸后Nrf2表達的降低伴隨著ROS產(chǎn)生的增加（圖3 C）。
（A）Nrf2（100 kDa）和β-肌動蛋白（42 kDa）的全細胞裂解物。（B）20% 循環(huán)拉伸4小時后Nrf2（100 kDa）和層粘連蛋白B1（70 kDa）表達的核裂解物蛋白質(zhì)印跡。（C）通過DCF（nM）量化ROS的生成，其隨拉伸而增加。


蘿卜硫素在拉伸的羊膜細胞中挽救獨立于 ROS 的 Nrf2

蘿卜硫素已被證明在特定的濃度下通過激活Nrf2信號通路能夠引發(fā)一連串抗氧化酶的產(chǎn)生，可有效減輕氧化應(yīng)激和組織/細胞損傷。由于Nrf2被認為在與早產(chǎn)相關(guān)的促炎途徑中發(fā)揮作用，因此對1、2 μM蘿卜硫素處理的細胞進行機械拉伸，以研究其對Nrf2易位和活性的影響。首先，利用LDH活性量化蘿卜硫素處理對細胞毒性的影響。在拉伸或?qū)φ諚l件下，0、1或2 μM蘿卜硫素處理后LDH活性沒有顯著差異（圖4 A）。此外，在hAECs拉伸4 h后，1 μM蘿卜硫素處理提高了57.8% 的核Nrf2水平，而2 μM蘿卜硫素處理導(dǎo)致核Nrf2水平顯著增加122.2%（圖4 B）。由于蘿卜硫素改善拉伸誘導(dǎo)Nrf2下調(diào)，因此還研究了其對ROS產(chǎn)生的影響。蘿卜硫素處理對hAECs的ROS產(chǎn)生沒有顯著影響，因為在所有蘿卜硫素濃度下，ROS隨拉伸而顯著增加（圖4 C）。
（A）動力學測量用蘿卜硫素處理的LDH活性。（B）蘿卜硫素處理下核Nrf2蛋白相對于層粘連蛋白B1的表達。（C）用蘿卜硫素處理的DCF生成。
（A-C）轉(zhuǎn)錄因子Nrf2和NF-kB的激活取決于細胞應(yīng)激的水平。（A）說明沒有明顯壓力的正常生理狀況。泛素化的Nrf2與KEAP1結(jié)合，NF-kB-p65與IkB結(jié)合，從而抑制它們易位到細胞核中。（B）中度壓力的影響，例如懷孕的第三個月。Nrf2與KEAP1分離，這允許核易位并與ARE基序特異性基因結(jié)合。NF-kB-p65仍然與細胞質(zhì)中的IkB結(jié)合。（C）嚴重的壓力導(dǎo)致分娩和細胞伸伸。升高的應(yīng)激導(dǎo)致KEAP1-Nrf2復(fù)合物的移除和IKKB的激活，從而抑制了IkB的抑制，激活了NF-kB-p65并導(dǎo)致二聚體易位到細胞核中并與RELB基序特異性基因結(jié)合。（D、E）人羊膜上皮細胞（D）未拉伸，（E）拉伸20%。拉伸的細胞增加細胞質(zhì)ROS，HMGB1的分泌和LDH活性。還顯示總Nrf2和核Nrf2減少，核NF-kB-p65增加。


該研究重點是了解了妊娠末期拉伸對胎膜的作用。它是第一個確定機械拉伸對轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達的影響以及HMGB1分泌和細胞內(nèi)ROS水平變化的，特別是在hAECs中（圖5）。先前的工作表明，拉伸會導(dǎo)致hAECs分泌的IL-6和PBEF增加，因此結(jié)合新數(shù)據(jù)，支持了這種形式的細胞應(yīng)激刺激可以在羊膜中促炎的一般論點。為了進一步支持研究結(jié)果，先前已經(jīng)表明，沉默原代羊膜細胞中的Nrf2會增加促炎細胞因子IL-6和趨化因子IL-8的表達和分泌。因此，在該研究中，蘿卜硫素對Nrf2降低的拯救表明，Nrf2的激活可以被操縱來產(chǎn)生抗炎和抗氧化過程，這些過程對及時分娩和健康的妊娠結(jié)果很重要。

參考文獻：Padron JG, Norman Ing ND, Ng PK, Kendal-Wright CE. Stretch Causes Cell Stress and the Downregulation of Nrf2 in Primary Amnion Cells. Biomolecules. 2022 May 31;12(6):766. doi: 10.3390/biom12060766. PMID: 35740891; PMCID: PMC9220942.

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