流動(dòng)依賴性剪切應(yīng)力影響人牙髓中分離的周細(xì)胞樣細(xì)胞的生物學(xué)特性

周細(xì)胞是類似于血管平滑肌細(xì)胞的一類細(xì)胞，因定位于毛細(xì)血管及微血管基膜周圍而得名。值得注意的是，周細(xì)胞的生物學(xué)行為依賴于內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）通過(guò)激活多種通路和釋放促血管生成因子（如PDGF-B、Ang-1/Ang-2/Tie2）施加的控制，這些因子在胚胎或病理血管生成中至關(guān)重要。此外，ECs和周細(xì)胞之間的相互作用不僅受到生化刺激的影響，還受到機(jī)械/物理因素的影響，包括血壓和流動(dòng)依賴的剪切應(yīng)力，這些因素也可能影響它們的串?dāng)_和細(xì)胞功能。事實(shí)上，流動(dòng)依賴性剪切應(yīng)力（FSS）在不同的病理狀況中起著關(guān)鍵作用，包括慢性肝病。FSS改變可能會(huì)影響間質(zhì)微環(huán)境和歸巢細(xì)胞的生物學(xué)行為，導(dǎo)致炎癥過(guò)程和促纖維化轉(zhuǎn)變。這些變化可能相互支持。

人牙髓分離的周細(xì)胞樣細(xì)胞（hDPSCs）具有獨(dú)特的干細(xì)胞特性，賦予它們高增殖率、免疫調(diào)節(jié)特性和低免疫原性。研究證明，與預(yù)先激活的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）共培養(yǎng)的hDPSCs通過(guò)激活免疫檢查點(diǎn)（包括PD1 / PD-L1和Fas / FasL通路）以及調(diào)節(jié)主要參與炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子的表達(dá)來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)/抗炎特性。

了解炎癥和干細(xì)胞之間的串?dāng)_引起了科學(xué)界的巨大興趣，因?yàn)樗�可能闡明干細(xì)胞響應(yīng)組織損傷的激活機(jī)制以及如何塑造它們以保持組織穩(wěn)態(tài)�；�于這些前提，意大利摩德納雷焦艾米利亞大學(xué)醫(yī)學(xué)、牙科和形態(tài)學(xué)科學(xué)系的研究團(tuán)隊(duì)為了更好地闡明周細(xì)胞在FSS誘導(dǎo)的病理狀況中的作用，使用了從人牙髓中分離的周細(xì)胞樣細(xì)胞群，評(píng)估了流動(dòng)依賴性剪切應(yīng)力如何影響 hDPSCs 的生物學(xué)特性，以預(yù)測(cè)它們?cè)谏�理和病理生理�(xiàng)l件下的潛在作用。
周細(xì)胞樣細(xì)胞的血管生成潛力

周細(xì)胞與血管生成密切相關(guān)，并參與血流動(dòng)力學(xué)過(guò)程。此外，血管周圍的細(xì)胞表達(dá)PDGFR-β，這是一種典型的周細(xì)胞標(biāo)志物。該研究的第一個(gè)目的是確認(rèn)hDPSCs的血管生成能力�？傮w而言，在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化期間，hDPSCs失去了其典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。在定型3天和5天后，細(xì)長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化。誘導(dǎo)7天后，細(xì)胞組裝成線狀血管（圖1 A）。鬼筆環(huán)肽染色進(jìn)一步支持這些數(shù)據(jù)（圖1 B）。同時(shí)，對(duì)分化的hDPSCs的WB分析顯示，與未分化的hDPSCs相比，PDGFR-β表達(dá)在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低。HUVEC細(xì)胞不表達(dá)PDGFR-β，證實(shí)其內(nèi)皮表型（圖1 C）。免疫熒光圖像證實(shí)這一結(jié)果（圖1 D）。

Cleaved Caspase-3的蛋白質(zhì)印跡分析顯示，內(nèi)皮誘導(dǎo)不影響hDPSCs的細(xì)胞活力（圖1 E）。此外還研究了典型內(nèi)皮標(biāo)志物ANGPT1，Tie2，eNOS和VEGF的表達(dá)。WB分析顯示，eNOS和VEGF在內(nèi)皮細(xì)胞分化過(guò)程中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的上調(diào)，在作為陽(yáng)性對(duì)照的HUVEC中達(dá)到相似的表達(dá)。關(guān)于Tie2受體的表達(dá)，僅在誘導(dǎo)7天時(shí)觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著升高，而在其配體ANGPT1中沒(méi)有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。值得注意的是，所有這些內(nèi)皮標(biāo)志物的基礎(chǔ)水平在未分化的hDPSCs中表達(dá)，表明它們具有血管生成潛力。為了評(píng)估hDPSCs形成管狀結(jié)構(gòu)的能力，進(jìn)行了功能測(cè)定。結(jié)果表明，在未分化的hDPSCs中也觀察到管狀血管網(wǎng)絡(luò)的形成。在誘導(dǎo)內(nèi)皮分化后，hDPSCs的這種能力顯著增強(qiáng)。

流動(dòng)剪切應(yīng)力介導(dǎo)的效應(yīng)分析

剪切應(yīng)力作用于內(nèi)皮細(xì)胞和/或周細(xì)胞，可在血管穩(wěn)態(tài)和重塑以及病理生理學(xué)過(guò)程中起關(guān)鍵作用。許多細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括代表暴露于外部刺激的第一層的細(xì)胞膜，通過(guò)調(diào)整其形狀來(lái)響應(yīng)剪切應(yīng)力。基于這一考慮，實(shí)驗(yàn)接下來(lái)分析了流動(dòng)剪切應(yīng)力介導(dǎo)的效應(yīng)。暴露于FSS（1.5 dyn/cm2）的hDPSCs重新排列了它們的形態(tài)（圖2 A）。因此，細(xì)胞顯得更加細(xì)長(zhǎng)，失去了其典型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)（圖2 A，黑色箭頭）。為了排除FSS誘導(dǎo)干性表型改變的可能性，對(duì)在標(biāo)準(zhǔn)靜態(tài)條件下培養(yǎng)的hDPSCs和暴露于FSS（即動(dòng)態(tài)條件）的hDPSCs進(jìn)行了FACS分析。結(jié)果表明，F(xiàn)SS沒(méi)有改變兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組hDPSCs上典型MSCs標(biāo)志物的表達(dá)。事實(shí)上，幾乎所有的hDPSCs對(duì)CD73、CD90和CD105呈陽(yáng)性，而對(duì)CD34、CD45和HLA-DR呈陰性（圖2 B）。
 
在hDPSCs膜修飾反應(yīng)的初始機(jī)械感應(yīng)之后，可能發(fā)生了局部生化反應(yīng)和下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活。因此，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了暴露于FSS的hDPSCs的不同激活通路。如圖3 A，熱圖和直方圖揭示了不同信號(hào)機(jī)制的激活情況。首先，F(xiàn)SS沒(méi)有誘導(dǎo)hDPSCs中的促凋亡信號(hào)通路。通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)是Akt/mTOR通路響應(yīng)于脈動(dòng)單向流動(dòng)依賴性剪切應(yīng)力而被激活。與靜態(tài)條件下的hDPSCs相比，動(dòng)態(tài)條件下hDPSCs中Akt pS473的上調(diào)與mTOR pS2481顯著增加相關(guān)。同時(shí)，Akt pT308的磷酸化在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下都沒(méi)有變化，PDK1 s241的磷酸化在暴露于FSS的hDPSCs中顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，Akt/mTOR通路的激活是由于hDPSCs膜變形和機(jī)械傳感激活的。此外，值得注意的是，F(xiàn)SS誘導(dǎo)PD-L1免疫調(diào)節(jié)標(biāo)志物的顯著降低。同時(shí)，在動(dòng)態(tài)條件下維持的hDPSCs顯示出NFkB pS536的強(qiáng)烈上調(diào)，同時(shí)IKBα pS32 36的顯著降低，據(jù)報(bào)道其磷酸化與NFkB失活有關(guān)。這些數(shù)據(jù)可能表明，脈動(dòng)血流剪切應(yīng)力調(diào)節(jié)hDPSCs的促炎命運(yùn)。

有趣的是，F(xiàn)SS誘導(dǎo)eNOS pS117顯著下調(diào)，同時(shí)誘導(dǎo)eNOS pS113顯著上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，在eNOS活性受到抑制同時(shí)，F(xiàn)SS也影響hDPSCs血管生成的潛在傾向。通過(guò)典型血管生成標(biāo)志物（VEGF、ANGPT1 和 eNOS）的免疫熒光染色和管形成測(cè)定證實(shí)了這一數(shù)據(jù)。特別是假色分析顯示，暴露于動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件的hDPSCs中VEGF，ANGPT1和eNOS的表達(dá)降低（圖3 B）。同時(shí)，與靜態(tài)培養(yǎng)條件下的hDPSCs相比，在動(dòng)態(tài)條件下hDPSCs中管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著減少（圖3 C），從而證實(shí)FSS也影響了hDPSCs形成管狀血管網(wǎng)絡(luò)的能力及其隨后的血管生成潛力。
 
hDPSCs對(duì)流動(dòng)依賴性剪切應(yīng)力下的免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)

最后，實(shí)驗(yàn)研究了動(dòng)態(tài)流動(dòng)條件對(duì)hDPSCs與預(yù)激活的CD3/CD28 hPBMCs之間共培養(yǎng)模擬的炎癥微環(huán)境的影響（圖4 A）。在與有或沒(méi)有FSS的PBMCs共培養(yǎng)后，由RPPA對(duì)hDPSCs進(jìn)行生物學(xué)分析。之前已經(jīng)確認(rèn)了機(jī)械傳感轉(zhuǎn)導(dǎo)激活了Akt/mTOR通路。特別是，如圖4 A，直方圖顯示，與靜態(tài)條件下的hDPSCs相比，動(dòng)態(tài)條件下hDPSCs中 Akt pS473的顯著增加與mTOR pS2481增加相關(guān)。此外，在兩種實(shí)驗(yàn)條件下，Akt pT308的磷酸化均未檢測(cè)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，而在與暴露于FSS的PBMCs共培養(yǎng)后，PDK1 S241的磷酸化在hDPSCs中顯著降低。在該共培養(yǎng)系統(tǒng)中，暴露于FSS的hDPSCs的eNOS活性受到抑制，如eNOS pS117的顯著下調(diào)以及eNOS pS113的顯著上調(diào)（圖4 A）。隨后，還研究了與PBMCs共培養(yǎng)后暴露或不暴露于FSS的hDPSCs的免疫調(diào)節(jié)特性。與靜態(tài)條件下的hDPSCs相比，F(xiàn)SS的應(yīng)用在動(dòng)態(tài)條件下大大降低了hDPSCs中PD-L1的表達(dá)（圖4 A）。同時(shí)，在與PBMCs共培養(yǎng)后，動(dòng)態(tài)條件下hDPSCs的NFkB pS536明顯增加，IKBα pS32 36顯著降低（圖4 A），表明促炎命運(yùn)是由FSS驅(qū)動(dòng)的。

為了確認(rèn)hDPSCs在免疫調(diào)節(jié)中的可塑性，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了在靜態(tài)和動(dòng)態(tài)條件下預(yù)激活的PBMCs與hDPSCs共培養(yǎng)后的細(xì)胞內(nèi)炎性細(xì)胞因子。FACS分析表明，在靜態(tài)或動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)后，PBMCs中hDPSCs的污染最小且相當(dāng)（圖4 B）。具體而言，與靜態(tài)條件下相比，F(xiàn)SS能夠誘導(dǎo)動(dòng)態(tài)條件下單獨(dú)預(yù)激活的PBMCs中所有細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)水平的上調(diào)。此外，在動(dòng)態(tài)條件下進(jìn)行hDPSCs共培養(yǎng)后，PBMCs中IFNγ、TNFα、IL-2、IL-10和IL-6的mRNA表達(dá)水平顯著增加（圖4 C）。相反，與在靜態(tài)條件下單獨(dú)培養(yǎng)的PBMCs相比，在靜態(tài)條件下與hDPSCs共培養(yǎng)后，PBMCs中檢測(cè)到細(xì)胞因子水平（IFNγ，TNFα，IL-2，IL-10）的下調(diào)（圖4 C），除了IL-6在hDPSCs靜態(tài)條件共培養(yǎng)后上調(diào)（圖4 C）。這些數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)SS對(duì)hDPSCs的促炎行為產(chǎn)生了強(qiáng)烈的影響。
綜上所述，可以說(shuō)機(jī)械力可能決定hDPSCs的生物學(xué)命運(yùn)，hDPSCs可能在由炎癥微環(huán)境建立驅(qū)動(dòng)的疾病發(fā)展過(guò)程中被激活，例如自身免疫性疾病和癌前病變。在這方面，已知間充質(zhì)干細(xì)胞與免疫細(xì)胞具有活躍的相互作用，因此可能通過(guò)充當(dāng)炎癥的傳感器和切換器來(lái)顯示抗炎和促炎作用。此外，該研究的數(shù)據(jù)為理解周細(xì)胞樣細(xì)胞和機(jī)械力在炎癥依賴性疾病的觸發(fā)和發(fā)展中的潛在作用提供了引導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：Bertani G, Di Tinco R, Bertoni L, Orlandi G, Pisciotta A, Rosa R, Rigamonti L, Signore M, Bertacchini J, Sena P, De Biasi S, Villa E, Carnevale G. Flow-dependent shear stress affects the biological properties of pericyte-like cells isolated from human dental pulp. Stem Cell Res Ther. 2023 Feb 18;14(1):31. doi: 10.1186/s13287-023-03254-2. PMID: 36805780; PMCID: PMC9938980.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36805780/

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