力誘導(dǎo)的一氧化氮促進(jìn)小鼠正畸牙齒移動(dòng)期間的成骨活性

正畸牙齒移動(dòng)（OTM）是一個(gè)機(jī)械力誘導(dǎo)牙周組織改建的過(guò)程。壓力側(cè)的牙槽骨吸收和張力側(cè)新骨再生的平衡決定了OTM的速度。一氧化氮（NO）已被證明對(duì)骨代謝有影響。NO供體對(duì)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和骨形成具有有益的影響。同時(shí)，它們會(huì)降低破骨細(xì)胞的活性。研究指出，牙周組織在正畸力的作用下產(chǎn)生NO。NO的前體（L-精氨酸）加速了大鼠的OTM，增加了壓力側(cè)破骨細(xì)胞的數(shù)量和Howship腔隙，而抑制NO產(chǎn)生的NOS（一氧化氮合酶）抑制劑會(huì)減少OTM。因此，NO也對(duì)OTM產(chǎn)生了重大影響。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了三種NOS亞型：神經(jīng)元型（nNOS）、內(nèi)皮細(xì)胞型（eNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）。已經(jīng)證明，eNOS介導(dǎo)張力側(cè)的骨形成，而iNOS介導(dǎo)壓力側(cè)的骨吸收。eNOS和iNOS似乎是OTM過(guò)程中骨重塑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們主要分布在骨細(xì)胞中。與骨細(xì)胞不同，牙周膜細(xì)胞在早期OTM階段更傾向于成為機(jī)械傳感器，與NO信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）是間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），對(duì)維持牙周組織的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。先前的證據(jù)表明，hPDLSCs參與OTM過(guò)程。循環(huán)拉伸力（CTF）促進(jìn)hPDLSCs中成骨基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)，如堿性磷酸酶、RUNX2、osterix 蛋白和骨橋蛋白。此外，機(jī)械應(yīng)變可以刺激hPDLSCs分化成成骨細(xì)胞。

在首都醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸學(xué)教研室及全牙再生與口腔組織功能重建實(shí)驗(yàn)室小組的一項(xiàng)研究中報(bào)道了hPDLSCs可以產(chǎn)生NO，NO具有促進(jìn)PDLSCs成骨分化的能力。在這項(xiàng)研究中，重點(diǎn)研究了模擬OTM的過(guò)程的機(jī)械拉伸力對(duì)hPDLSCs產(chǎn)生NO變化的影響，還發(fā)現(xiàn)了骨代謝的變化以及這一過(guò)程中涉及的潛在信號(hào)通路。
正畸力誘導(dǎo)體內(nèi)NO產(chǎn)生和NOS表達(dá)

為了研究體內(nèi)OTM過(guò)程中NO的產(chǎn)生，使用小鼠正畸力（30g）模型進(jìn)行研究（圖1 a）。施加力7天后，OTM的HE和顯微CT分析顯示，第一磨牙向內(nèi)側(cè)移動(dòng)。觀察到遠(yuǎn)端牙周膜變寬，而近中端牙周膜受壓（圖1 b-d）。與對(duì)照組相比，NO2- 濃度在施加正畸力的小鼠血清中升高（圖1 e）。
力誘導(dǎo)的NO調(diào)節(jié)OTM過(guò)程和骨形成

為研究力誘導(dǎo)的NO產(chǎn)生對(duì)OTM過(guò)程的影響，注射NOS抑制劑L-NMMA抑制其生成，并注射NO前體L-精氨酸以增加OTM過(guò)程中的內(nèi)源性NO生成（圖1 f-g）。施加力7天后，測(cè)量上頜第一磨牙和第二磨牙之間的距離。與對(duì)照組相比，L-NMMA對(duì)NOS的抑制作用縮短了OTM的距離。同時(shí)，注射L-精氨酸上調(diào)了NO水平并增加OTM的距離。

免疫組織化學(xué)染色顯示，與PBS對(duì)照組相比，在OTM期間阻斷內(nèi)源性NO的產(chǎn)生可抑制張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽(yáng)性hPDLSCs和骨細(xì)胞的積累（圖2 a、b、d）。為了進(jìn)一步確認(rèn)NO在OTM中的功能，注射了L-精氨酸以提高小鼠的NO水平。結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組相比，張力側(cè)牙周膜和牙槽骨中堿性磷酸酶陽(yáng)性hPDLSCs和骨細(xì)胞的積累增加（圖2 a、c、d）。 （a-c）遠(yuǎn)端張力側(cè)的代表性免疫組織化學(xué)圖像。（b、d）L-NMMA注射顯著抑制牙周膜堿性表達(dá)，促進(jìn)堿性磷酸酶的表達(dá)。

循環(huán)拉伸力在體外誘導(dǎo)NO生成和NOS表達(dá)

接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)研究了hPDLSCs的NO產(chǎn)生，這在OTM的骨形成過(guò)程中非常重要。此外，通過(guò)免疫染色評(píng)估發(fā)現(xiàn)人hPDLSCs表達(dá)eNOS和iNOS。為了研究NO產(chǎn)生的機(jī)制，對(duì)hPDLSCs施加循環(huán)拉伸力（10%伸長(zhǎng)率，0.5 Hz，6、12、24 h），以在體外探索機(jī)械力對(duì)NO產(chǎn)生的影響。已經(jīng)證明，hPDLSCs在沒(méi)有力刺激的情況下產(chǎn)生NO。檢測(cè)hPDLSCs的培養(yǎng)上清液中NO2- 的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在12小時(shí)和24小時(shí)后顯著增加（圖3 a）。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，eNOS和iNOS蛋白表達(dá)上調(diào)，qPCR結(jié)果顯示相同的趨勢(shì)（圖3 b、c）。這些數(shù)據(jù)表明，施加CTF在hPDLSCs中促進(jìn)NO 生成，這可能對(duì)生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。
力誘導(dǎo)的 NO 可能會(huì)調(diào)節(jié) OTM 期間張力側(cè)的骨形成

實(shí)驗(yàn)假設(shè)OTM期間張力側(cè)的骨形成可能是力誘導(dǎo)的NO通過(guò)hPDLSCs的成骨分化調(diào)控的。先前的研究表明，循環(huán)拉伸力促進(jìn)了hPDLSCs的成骨分化。實(shí)驗(yàn)用CTF處理hPDLSCs 持續(xù)0小時(shí)，6小時(shí)，12小時(shí)和24小時(shí)，qPCR檢測(cè)到RUNX2，Osterix和骨橋蛋白mRNA水平升高（圖3 d）。RUNX2的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示出相同的趨勢(shì)（圖3 e）。

為了研究不同濃度的NO對(duì)成骨的影響，用L-NMMA處理hPDLSCs以降低NO2- 的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在體外循環(huán)拉伸力下，外源NO供體硝普鈉（SNP）增加NO2-的濃度（圖3 f）。qPCR結(jié)果顯示，在CTF期間NO產(chǎn)生受到抑制時(shí)，RUNX2、Osterix和骨橋蛋白mRNA表達(dá)降低，而在CTF期間促進(jìn)NO生成時(shí)，它們的表達(dá)增加（圖3 g）。RUNX2的蛋白質(zhì)印跡顯示出相同的趨勢(shì)（圖3 h）。

hPDLSCs 中的力誘導(dǎo)的 NO 可能調(diào)控 PI3K/Akt 信號(hào)通路

為了研究力誘導(dǎo)的NO如何影響hPDLSCs的成骨，實(shí)驗(yàn)分析了NO下游通路PI3K/Akt。刺激hPDLSCs后，p-PI3K、p-Akt和活性β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平上調(diào)（圖4 a）。然后，用PI3K抑制劑LY294002 處理hPDLSCs，發(fā)現(xiàn)p-PI3K、p-Akt和活性β-連環(huán)蛋白的表達(dá)水平下調(diào)（圖4 b）。此外，用NO抑制劑L-NMMA處理hPDLSCs，發(fā)現(xiàn)L-NMMA抑制了CTF處理下hPDLSCs中PI3K/Akt通路的促進(jìn)（圖4 c）。
由于NO在OTM中的功能作用尚未完全闡明，該研究證明，力誘導(dǎo)的內(nèi)源性NO促進(jìn)PDLSCs的成骨活性，有助于維持OTM期間牙槽骨的穩(wěn)態(tài)。NO是調(diào)節(jié)OTM過(guò)程所必需的，NO水平的降低導(dǎo)致OTM距離縮短。隨著對(duì)NO在OTM中的作用的認(rèn)識(shí)的加深，可能會(huì)帶來(lái)一種基于NO供體的OTM的加速治療方法。

參考文獻(xiàn)：Sun Y, Fu J, Lin F, Li S, Du J, Liu Y, Bai Y. Force-Induced Nitric Oxide Promotes Osteogenic Activity during Orthodontic Tooth Movement in Mice. Stem Cells Int. 2022 Sep 6;2022:4775445. doi: 10.1155/2022/4775445. PMID: 36110889; PMCID: PMC9470363.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36110889/

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