雜交瘤細(xì)胞技術(shù)定義、原理詳解

雜交瘤細(xì)胞（hybridoma）是一種在制備單克隆抗體過程中，用骨髓瘤細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞融合而成的細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞一般通過瘤細(xì)胞培養(yǎng)來制備。
雜交瘤技術(shù)是指兩個或兩個以上細(xì)胞合并形成一個細(xì)胞的現(xiàn)象。他可使兩個不同來源的細(xì)胞核在同一細(xì)胞中表達(dá)功能。
 
雜交瘤抗體技術(shù)的基本原理是通過融合兩種細(xì)胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養(yǎng)基中生長，小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才具有持續(xù)增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞，這種雜種細(xì)胞叫做雜交瘤細(xì)胞。
 
雜交瘤技術(shù)（hybridoma technique）
即淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，又稱單克隆抗體技術(shù)。它是在體細(xì)胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的�？死眨↘ohler）和米爾斯坦（Milstein）（1975）證明，骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動物脾細(xì)胞融合，形成能分泌針對該抗原的均質(zhì)的高特異性的抗體——單克隆抗體，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。骨髓瘤細(xì)胞在體外可以連續(xù)傳代，而脾細(xì)胞是終末細(xì)胞，不能在體外繁殖。如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌某種抗體或因子的淋巴細(xì)胞融合，則融合細(xì)胞既具有腫瘤細(xì)胞無限繁殖的特性，又具有淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體或因子的能力，同時也克服了免疫淋巴細(xì)胞不能在體外繁殖的缺點(diǎn)，融合的細(xì)胞稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。
 
雜交瘤技術(shù)基于三種關(guān)鍵技術(shù)。
一、動物免疫
 
將特定的抗原注射到哺乳動物（如小鼠）體內(nèi)，在外來抗原刺激下，被免疫動物脾臟內(nèi)的B淋巴細(xì)胞大量增殖并且分泌針對于該抗原的特異性抗體。動物免疫的作用就是用特定外來抗原對動物進(jìn)行免疫，以刺激能分泌特異性抗體的B淋巴細(xì)胞大量增殖。
 
二、細(xì)胞融合
 
B淋巴細(xì)胞受外來抗原刺激后可以分泌抗體，但B淋巴細(xì)胞本身是一種終末分化細(xì)胞，通常不再進(jìn)行細(xì)胞分裂，存活一段時間（兩周）便死亡-短命細(xì)胞；而骨髓瘤細(xì)胞不分泌抗體，卻能在體外無限增殖存活。如果能將這兩種細(xì)胞的特性結(jié)合起來，就能得到既能分泌抗體又能在體外長期存活的細(xì)胞，細(xì)胞融合雜交瘤細(xì)胞中非常關(guān)鍵的一個步驟。
 
三、雜交瘤細(xì)胞篩選
篩選雜交瘤細(xì)胞一般使用HAT培養(yǎng)基。
 
HAT培養(yǎng)基篩選方法基本原理：
 
HAT培養(yǎng)基成分：含有次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三種成分。
 
細(xì)胞DNA合成途徑：主要合成和補(bǔ)救合成途徑兩種方式。主要合成就是利用糖和氨基酸在二氫葉酸還原酶的催化下來合成DNA；而補(bǔ)救合成途徑則是通過次嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase， HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase，TK)將核苷酸前體合成核苷酸以供DNA合成原料。
 
HAT培養(yǎng)基中氯基喋呤是二氫葉酸還原酶的抑制劑，能有效地阻斷DNA合成的內(nèi)源性途徑。融合前的骨髓瘤細(xì)胞不能產(chǎn)生抗體，并且缺乏次黃嘌呤  – 鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）基因，使得它們對HAT培養(yǎng)基敏感，阻斷了DNA補(bǔ)救合成途徑。
 
將融合的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中孵育大約10至14天，未融合的以及自身融合的骨髓瘤細(xì)胞死亡。這是因為HAT培養(yǎng)基阻斷了骨髓瘤細(xì)胞兩大DNA合成途徑。未融合的以及自身融合的B淋巴細(xì)胞雖然能夠合成HGPRT酶，但其是正常細(xì)胞，存活一段時間（兩周）也死亡。因此，在HAT養(yǎng)基中，只有B細(xì)胞-骨髓瘤雜合體存活，因為雜交瘤細(xì)胞繼承了B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的雙重特性，能夠合成HGPRT酶和TK酶。這些雜交瘤細(xì)胞能夠分泌抗體（B細(xì)胞特性）并且無限增殖（骨髓瘤細(xì)胞特性）。
 
然后將培養(yǎng)基稀釋到多孔板中，使得每個孔僅含有一個雜交瘤細(xì)胞。再由這些單細(xì)胞克隆生長，最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株。由于孔中的抗體由相同的B細(xì)胞產(chǎn)生，針對相同的抗原表位，所以產(chǎn)生的抗體又被稱之為單克隆抗體。
 
接下來采用體內(nèi)或者體外方式對篩選的能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，最后收集提純獲取單抗。
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